Возбудимость - способность клеток и тканей переходить в состояние физиологической активности иод влиянием каких-либо внешних воздействий (раздражителей), достигших пороговой величины. Возбудимостью обладают любые живые клетки, в том числе растительные, но в наибольшей степени она выражена у клеток животных - таких, как нервные, мышечные и железистые.
Любому специалисту, связанному с исследованиями организма животного и человека, необходимо понимать, что именно возбудимые клетки составляют основу НС, воспринимают сигналы из внешней и внутренней среды организма, обеспечивают его ответные реакции.
Все возбудимые клетки обладают тремя свойствами:
1) ПН, или мембранным потенциалом, - разностью электрического потенциала между внутриклеточной средой и средой, окружающей клетку;
- 2) IIД - способностью генерировать краткий электрический ответ под действием любого раздражителя, интенсивность которого достигла определенного порога;
- 3) проводимостью - способностью распространять ПД по телу клетки и ее отросткам.
Проведем следующий эксперимент. Если взять нейрон, находящийся в настоящий момент в состоянии покоя, и ввести тонкий стеклянный микроэлектрод с кончиком диаметром не более 1 мкм, то такой кончик не нанесет клетке видимых повреждений. Полость стеклянного электрода должна быть заполнена жидкостью, хорошо проводящей ток (электролитом). Чаще всего для этой цели используют раствор хлористого калия (КС1). Электрод соединяют с вольтметром. Пока кончик электрода находится в межклеточной среде, стрелка микровольтметра стоит на нуле (рис. 8.1).
Рис . 8.1.
а - рисунок с микрофотографии; б - схема регистрации потенциала покоя путем
введения в нейрон кончика микроэлектрода; в - скачок мембранного потенциала в момент введения в нейрон кончика микроэлектрода (4)
В момент прокалывания мембраны нейрона регистрируется скачок потенциала вниз до уровня приблизительно -70 мВ. Это и есть мембранный потенциал, или ПП. Если электрод не двигать, а для нейрона создать правильные условия (состав окружающего раствора, температура), то ПП будет поддерживаться без всяких видимых изменений в течение нескольких часов. ПП найден во всех возбудимых клетках, и его величина колеблется от -30 до -100 мВ в зависимости от того, с какими клетками проводится опыт.
Потенциал покоя был открыт в середине XIX в. великим швейцарским физиологом Эмилем Дюбуа-РеймоноМу а его ученик Юлиус Бернштейн создал самую первую теорию, которая объясняла, почему внутри возбудимых клеток, находящихся в состоянии покоя, регистрируется явный избыток отрицательных зарядов. Исходя из данных, полученных целым рядом исследователей, Бернштейн частично установил, а частично предположил следующее:
- - в цитоплазме возбудимых клеток содержится гораздо больше ионов К + , чем в окружающей среде, а ионов Na + и С1~ - гораздо меньше;
- - возбудимые клетки покрыты полупроницаемой мембраной, которая в состоянии покоя свободно пропускает ионы Na + , Са 2+ , С1 _ и т.д.
Если это так, то часть ионов К + должна выходить через клеточную мембрану в межклеточную среду, оставляя в клетке избыток парных К + отрицательно заряженных частиц - анионов.
Поэтому на внутренней поверхности мембраны клетки создается отрицательный заряд (рис. 8.2).
Рис. 8.2. Роль ионов К + в возникновении и поддержании потенциала покоя (ПП):
а - возникновение ПП вследствие диффузии ионов К + через постоянно открытые каналы утечки; б - изменение уровня ПП при изменении концентрации К* во
внешней среде
Но избыток отрицательно заряженных частиц будет притягивать к себе ионы К + , препятствуя их выходу из клетки, а вышедшие в межклеточное пространство ионы К" также будут «отталкивать» положительно заряженные частицы, не давая выйти из клетки новым порциям К + . В итоге выход К + продолжается лишь до тех пор, пока сила диффузии (концентрационного давления) и сила электрического ноля не станут равны. Точка равновесия и соответствует уровню потенциала покоя.
Ток ионов при достижении ПП не останавливается, так как имеются постоянно открытые каналы и К + продолжает перемещаться сквозь мембрану, но число ионов, которые вошли в клетку и вышли из нее, теперь оказывается одинаковым. Такое состояние называется динамическим равновесием - равенством двух противоположно направленных процессов. Если один из процессов усилится или ослабнет, то точка равновесия сместится. Например, если, как это делал Бернштейн, искусственно увеличить концентрацию К + в межклеточной среде, то это, естественно, будет мешать выходу из клетки новых порций положительно заряженных частиц (К +), и ПП станет менее отрицательным, смещаясь к нулю (см. рис. 8.2). Если же искусственно уравнять концентрацию К + в цитоплазме и вне клетки, то ПП будет равен нулю. Так Бернштейн доказал, что ПП в возбудимой клетке определяется разницей концентрации К + внутри этой клетки и во внеклеточной среде. Бернштейн предложил для количественной оценки ПП использовать уравнение, выведенное Вальтером Нернстом для искусственной системы, представляющей собой два раствора КС1 различной концентрации, разделенных искусственной мембраной, проницаемой только для К + (рис. 8.3).
Рис. 83.
а - принципиальная схема установки с двумя сосудами (1 и 2), содержащими разные концентрации КС1 и разделенными мембраной, проницаемой только для К + ;
6 - поток (показан стрелками) катионов (+) через мембрану из области с их большей концентрацией (1) в область с меньшей концентрацией (2), приводящий к возникновению на мембране потенциала
В один сосуд он налил 10%-ный раствор КС1, а во второй - 1%-ный раствор этой соли. В обоих растворах произошла диссоциация КС1 на К + и СП, но в сосуде 1 исходно было в 10 раз больше и катионов (К +), и анионов (С1“), чем в сосуде 2. Так как разделяющая растворы полупроницаемая мембрана хорошо пропускает катионы, то часть ионов калия (К +) перешла из сосуда 1, где концентрация КС1 исходно была выше, в сосуд 2, в котором концентрация КС1 была в 10 раз ниже. Поскольку ионы калия несут положительный заряд, то положительных зарядов в сосуде 2 будет больше, чем отрицательных. В сосуде 1 таким образом окажется некоторый избыток «брошенных» анионов хлора, потерявших свои катионы калия. Но отрицательно заряженные ионы С1“ будут притягивать назад часть положительно заряженных ионов К + за счет взаимодействия электрических зарядов. Через какие-то мгновения потоки К + из сосуда 1 в сосуд 2 и наоборот станут равными. Однако в сосуде 1 ионов К + будет все равно меньше, чем ионов С1 _ (ведь часть К* перешла в сосуд 2), а в сосуде 2 будет больше ионов К + , чем ионов С1 _ (за счет пришедших из сосуда 1). Следовательно, раствор в сосуде 1 будет заряжен отрицательно по отношению к раствору в сосуде 2.
Между растворами установится нернстовский потенциал, который, согласно уравнению Нернста, равен
где Е - величина потенциала, возникающего между растворами, налитыми в сосуд 1 и сосуд 2; R - газовая постоянная; Т - температура; F - число Фарадея; Z - валентность; [С { - концентрация ионов К + в сосуде 1; [С 2 ] концентрация ионов К + в сосуде 2.
Бернштейн предложил использовать приведенное выше уравнение Нернста для определения мембранного потенциала, как только узнал, что именно К + может проходить через мембрану покоящейся возбудимой клетки. Однако соотношение концентраций катионов калия внутри и снаружи клетки оказалось не 1: 10 (как в искусственной экспериментальной системе Нернста), а совсем другим. Так, в мышечных клетках калия в 49 раз больше, чем в среде, окружающей клетки. Зато в окружающей среде, т.е. вокруг возбудимых клеток, ионов натрия (Na +) приблизительно в 10 раз больше, чем внутри клеток. Однако, когда клетка находится в состоянии покоя, натрий не может проникать сквозь клеточную мембрану внутрь клетки и не участвует в создании 1111. За последние 70 лет многие ученые путем оригинальных экспериментов окончательно доказали, что отрицательный заряд покоящейся возбудимой клетки обусловлен тем, что часть ионов калия выходит через наружную мембрану во внешнюю среду до тех пор, пока не установится динамическое равновесие: сколько ионов калия вышло из клетки, столько же и войдет обратно. При этом на мембране устанавливается ПП, характерный для данного вида возбудимых клеток и определяемый тем, что в цитоплазме клетки остается избыток отрицательно заряженных ионов - анионов, главным образом, крупных белковых молекул, имеющих отрицательный заряд, «покинутых» катионами, т.е. ионами калия. Анионы пройти через мембрану не могут и остаются в клетке, определяя отрицательный заряд цитоплазмы.
Однако впоследствии было показано, что в мембране нейронов имеется небольшое количество постоянно открытых каналов для калия, по которым катионы натрия по градиенту концентрации (вокруг нейрона в 10 раз больше натрия, чем в цитоплазме) постоянно проникают в клетку, сдвигая 1111 к менее отрицательным значениям.
Входящий в клетку небольшой ток натрия (ток утечки), изменяя IIII, делает нейрон более возбудимым; чем этот ток значительнее, тем сильнее IIII сдвинут к тем пороговым величинам, за которыми следует переход нейрона в состояние возбуждения. Таким образом, возникает возможность поддерживать нейроны одних систем на высоком уровне возбудимости, а других - на пониженном. Как было выяснено, в межклеточной среде содержится в пять раз больше ионов хлора (С1“), чем в цитоплазме, однако в покое ток ионов хлора через наружную мембрану в клетку очень мал и составляет всего 4%, если сравнить с током ионов калия, но, строго говоря, для точного определения величины ГГП в уравнении Нернста надо подставить величины проницаемости для всех видов ионов, которые могут в покое проникать через мембрану клетки и менять ПП. Полученное уравнение носит имя Голдмана - Ходжкина - Катца:
где Р - проницаемость мембраны для соответствующих ионов.
Механизм генерации ПП, концентрация ионов вне и внутри клеток, проницаемость наружной мембраны для ионов - все это исследовалось на различных объектах, однако основной вид клеток, на котором проводились опыты, - нейроны кальмаров (точнее, аксоны этих нейронов). В 1930-е гг. было обнаружено, что аксоны нейронов некоторых нервных узлов (звездчатого ганглия) этих головоногих имеют гигантский диаметр (до 1 мм), и с ним очень удобно экспериментировать.
Итак, ПП возбудимой клетки определяется несколькими факторами, главными из которых, безусловно, являются разница концентраций К + внутри и снаружи клетки и свободный ток К + , идущий через мембрану. Определенную роль в генерации ПП играют слабые входящие токи Na + и С1“, для которых мембрана клетки, находящейся в состоянии покоя, почти непроницаема. Изменяя любой из этих параметров, можно в той или иной степени менять ПП, тем самым изменяя способность клетки к возбуждению.
Мысль о двух формах конвертируемой энергии я высказал в 1975 году. Спустя два года эта точка зрения была поддержана Митчелом. А в группе А. Глаголева тем временем начались опыты по проверке одного из предсказаний этой новой концепции.
Я рассуждал следующим образом. Если протонный потенциал - разменная монета, то клетка должна располагать достаточным количеством, таких «денежных знаков».
Это требование выполнялось, если речь шла об АТФ. Клетка всегда содержит довольно большие количества АТФ, причем приняты меры для стабилизации этого количества в условиях меняющейся конъюнктуры - непрерывно варьирующих скоростей образования и использования АТФ. Есть особое вещество - креатин-фосфат, участвующее только в одной реакции - фосфорилировании АДФ:
АДФ + креатинфосфат ⇔ АТФ + креатин.
Когда АТФ в избытке, а АДФ в дефиците, реакция идет справа налево и накапливается креатинфосфат, которого в этих условиях становится много больше, чем АТФ. Но стоит повыситься уровню АДФ и уменьшиться АТФ, как реакция меняет направление, и креатинфосфат оказывается поставщиком АТФ. Тем самым креатинфосфат выполняет свою функцию стабилизатора, буфера уровня АТФ.
А как обстоят дела с протонным потенциалом?
Несложный расчет позволяет перевести одну энергетическую «валюту» в другую. Этот расчет показывает, что количество энергии, накопленное, к примеру, бактериальной клеткой в виде протонного потенциала, оказывается почти в тысячу раз меньшим, чем количество АТФ, если протонный потенциал находится в электрической форме. Это количество одного порядка с числом генераторов и потребителей потенциала в бактериальной мембране.
Такая ситуация создает особую необходимость в буферной системе, стабилизирующей уровень протонного потенциала. В противном случае даже кратковременное превышение общей скорости потребляющих потенциал процессов над скоростью его генерации приведет к исчезновению потенциала и остановке всех систем, питаемых потенциалом.
Итак, должен быть буфер для протонного потенциала наподобие креатинфосфата для АТФ. Но что за компонент подобрала природа на такую роль?
Обдумывая эту проблему, я попытался найти какую-нибудь связанную с потенциалом биологическую систему, функция которой была бы неизвестна.
Одна из старых загадок биологии: зачем клетка поглощает ионы калия и выбрасывает ионы натрия, создавая дорогостоящую асимметрию в распределении этих близких по своим свойствам ионов между цитоплазмой и окружающей средой? Практически в любой живой клетке ионов калия намного больше, чем ионов натрия, в то время как в среде натрий находится в огромном избытке над калием. Может быть, Na + - яд для клетки?
Нет, это не так. Хоть некоторые ферментные системы действительно лучше работают в КСl, чем в NaCl, это выглядит вторичным приспособлением к «многокалиевой» и «малонатриевой» внутренней среде клетки. За огромный срок биологической эволюции клетка могла бы приспособиться к естественному соотношению ионов щелочных металлов во внешней среде. Живут же галофильные бактерии в насыщенном растворе NaCl, причем концентрация Na + в их цитоплазме иногда доходит до моля на литр, что почти в тысячу раз больше концентрации Na + в обычных клетках. Итак, Na + не яд.
Заметим, что те же галофильные бактерии поддерживают внутриклеточную концентрацию К + около 4 молей на литр, тратя на создание натрий-калиевого градиента колоссальные по масштабам клетки количества энергетических ресурсов.
Известно, что возбудимые клетки животных, такие, как нейроны, используют натрий-калиевый градиент для проведения нервного импульса. Но как быть с другими типами клеток, например, с бактериями?
Давайте обратимся к механизму транспорта К + и Na + через бактериальную мембрану. Известно, что между цитоплазмой бактерии и внешней средой существует разность электрических потенциалов, поддерживаемая работой белков-генераторов в бактериальной мембране. Откачивая протоны изнутри клетки наружу, белки-генераторы тем самым заряжают внутренность бактерии отрицательно. В этих условиях накопление ионов К + внутри клетки могло бы происходить просто за счет электрофореза - движения положительно заряженного иона калия в отрицательно заряженную цитоплазму бактерии.
При этом поток калия должен разряжать мембрану, предварительно заряженную протонными генераторами.
В свою очередь, разрядка мембраны должна немедленно активировать работу генераторов.
Это означает, что энергетические ресурсы, затрачиваемые на генерацию разности электрических потенциалов между клеткой и средой, будут использованы для концентрирования ионов К + внутри клетки. Конечным балансом такого процесса окажется обмен внутриклеточных ионов Н + на внеклеточные ионы К + (ионы Н + откачиваются белками-генераторами наружу, ионы К + поступают внутрь, двигаясь в электрическом поле, созданном движением ионов Н +).
Стало быть, внутри клетки будет создаваться не только избыток ионов К + , но и дефицит ионов Н + .
Этот дефицит можно использовать для откачки ионов Na + . Сделать это можно следующим образом. Известно, что бактерии располагают особым переносчиком ионов натрия, обменивающим Na + на Н + (этот переносчик носит название Nа + /Н + -антипортера). В условиях нехватки Н + в цитоплазме антипорт может компенсировать протонный дефицит, перенося Н + из внешней среды внутрь клетки. Произвести такой антипорт переносчик может только одним способом: обменяв внешний на внутренний Na + . Значит, движение ионов Н + внутрь клетки может быть использовано для откачки из той же клетки ионов Na + .
Вот мы и создали калий-натриевый градиент: внутри клетки накопили К + и откачали оттуда Na + . Движущей силой этих процессов был создаваемый белками-генераторами протонный потенциал. (Направление потенциала было таково, что внутренность клетки заряжалась отрицательно и там возникала нехватка ионов водорода.)
Допустим теперь, что протонные генераторы по какой-то причине выключились. Что произойдет в этих новых условиях с калий-натриевым градиентом?
Конечно же, он рассеется: ионы К + вытекут из клетки в окружающую среду, где их мало, ионы Na + войдут внутрь, где эти ионы в дефиците.
Но вот что интересно. Рассеиваясь, калий-натриевый градиент сам окажется генератором протонного потенциала того же направления, что образовывался при работе белков-генераторов.
Действительно, выход иона К + как положительно заряженной частицы создает диффузионную разность потенциалов на клеточной мембране со знаком «минус» внутри клетки. Вход Na + при участии Nа + /Н + - антипортера будет сопровождаться выходом Н + , то есть созданием дефицита Н + внутри клетки.
Так что же получается? Когда белки-генераторы работают, создаваемый ими протонный потенциал расходуется на образование калий-натриевого градиента. Зато когда они выключены (или их мощности недостает, чтобы удовлетворить многочисленных потребителей потенциала), калий-натриевый градиент, рассеиваясь, сам начинает генерировать протонный потенциал.
Так ведь это и есть буфер протонного потенциала, тот самый буфер, который так необходим для работы мембранных энергетических систем!
Схематично эту концепцию можно изобразить так:
Калий-натриевый градиент ↓ внешние энергетические ресурсы → протонный потенциал → работа.
Но если такая схема верна, то калий-натриевый градиент должен продлить работоспособность клетки в условиях, когда исчерпаны энергетические ресурсы.
А. Глаголев и И. Броун проверили справедливость этого вывода. Был взят мутант кишечной палочки, лишенный протонной АТФ-синтетазы. Для такого мутанта окисление субстратов кислородом служит единственным энергетическим ресурсом, пригодным, чтобы образовать протонный потенциал. Как было показано в свое время Дж. Адлером и его сотрудниками, мутант подвижен, пока в среде есть кислород.
Глаголев и Броун повторили опыт Адлера и убедились, что исчерпание запаса кислорода в растворе действительно останавливает бактерии, если они находятся в среде с КСl. В этих условиях калий-натриевый градиент отсутствует: калия много и в клетках и в среде, а натрия нет ни там, ни здесь.
А теперь давайте возьмем среду с NaCl. В таких условиях должны быть оба интересующих нас градиента: калиевый (калия много внутри и мало снаружи) и натриевый (натрия много снаружи и мало внутри). Гипотеза предсказывала, что в такой ситуации подвижность сохранится какое-то время и в бескислородных условиях, поскольку возможно превращение энергии:
калий-натриевый градиент → протонный потенциал → вращение флагеллы.
И в самом деле, бактерии двигались еще 15-20 минут после того, как измерительное устройство зарегистрировало нулевой уровень СЬ в среде.
Но особенно наглядным, как и следовало ожидать, оказался опыт с солелюбивыми бактериями, которые транспортируют очень большие количества ионов К + и Na + , чтобы создать калий-натриевый градиент. Такие бактерии быстро останавливались в темноте в бескислородных условиях, если в среде был КСl, и все еще двигались спустя девять (!) часов, если КСl был заменен на NaCl.
Эта величина - девять часов - интересна прежде всего как иллюстрация объема того резервуара энергии, который представляет собой калий-натриевый градиент у солелюбивых бактерий. Кроме того, она приобретает особый смысл, если вспомнить о том, что солелюбивые бактерии располагают бактериородопсином и, стало быть, способны к превращению энергии света в протонный потенциал. Ясно, что такое превращение возможно лишь в светлый период суток. А как быть ночью? Так вот оказывается, что энергии, запасенной днем в виде калий-натриевого градиента, хватает на всю ночь.
Утверждение, что калий-натриевый градиент играет роль буфера протонного потенциала, позволяет понять не только биологическую функцию этого градиента, но и причину, которая в течение многих лет препятствовала выяснению его значения для жизнедеятельности клетки. Мысль о буферной роли калий-натриевого градиента не могла родиться, прежде чем был открыт протонный потенциал и было доказано, что он служит конвертируемой формой энергии. Все эти годы проблема калия и натрия просто ждала своего часа.
Na + /K + насос или Na + /K + АТФ-аза это тоже, как и ионные каналы комплекс интегральных мембранных белков, которые могут не просто открыть путь для перехода иона по градиенту, а активно перемещать ионы против градиента концентрации. Механизм работы насоса представлен на рисунке 8.
Белковый комплекс в состоянии Е1, в этом состоянии насос чувствителен к ионам натрия и с цитоплазматической стороны с ферментом связываются 3 иона натрия
После связывание ионов натрия происходит гидролиз АТФ и выделяется энергия, необходимая для переноса ионов против градиента концентрации, освобождается АДФ неорганический фосфат (именно поэтому насос и называют Na + /K + АТФ-азой).
Насос меняет конформацию и переходит в состояние Е2. При этом места связывания ионов натрия оказываются обращенными наружу. В этом состоянии насос обладает низким сродством к натрию и ионы освобождаются во внеклеточную среду.
В конформации Е2 фермент обладает высоким сродством к калию и связывает 2 иона.
Происходит перенос калия, освобождение его во внутриклеточную среду и присоединение молекулы АТФ – насос вернулся в конформацию Е1, вновь приобрел сродство к ионам натрия и включается в новый цикл.
Рисунок 8 Механизм работы Na + /K + АТФ-азы
Обратите внимание на то, что Na + /K + насос переносит 3 иона натрия из клетки в обмен на 2 иона калия. Поэтому насос является электрогенным : суммарно за один цикл из клетки удаляется один положительный заряд. Транспортный белок выполняет от 150 до 600 циклов в секунду. Поскольку работа насоса представляет собой многоступенчатую химическую реакцию, она, подобно всем химическим реакциям, в значительной степени зависит от температуры. Другой характеристикой насоса является наличие уровня насыщения, это означает, что скорость работы насоса не может возрастать бесконечно при повышении концентрации транспортируемых ионов. В отличие от этого поток пассивно диффундирующего вещества растет пропорционально разности концентраций.
Помимо Na + /K + насоса мембрана содержит еще кальциевый насос, этот насос откачивает ионы кальция из клетки. Кальциевый насос присутствует с очень высокой плотностью в саркоплазматическом ретикулуме мышечных клеток. Цистерны ретикулюма накапливают ионы кальция в результате расщепления молекулы АТФ.
Итак,
результатом работы Na + /K + насоса
является трансмембранная разность
концентраций натрия и калия.
Выучите значения концентрация натрия,
калия и хлора (ммоль/л) вне и внутри
клетки!
Концентрация ионов внутри и вне клетки
Итак, есть два факта, которые необходимо учесть, чтобы понять механизмы, поддерживающие мембранный потенциал покоя.
1 . Концентрация ионов калия в клетке значительно выше, чем во внеклеточной среде. 2 . Мембрана в покое избирательно проницаема для К + , а для Nа + проницаемость мембраны в покое незначительна. Если принять проницаемость для калия за 1, то проницаемость для натрия в покое составит лишь 0,04. Следовательно, существует постоянный поток ионов К + из цитоплазмы по градиенту концентрации . Калиевый ток из цитоплазмы создает относительный дефицит положительных зарядов на внутренней поверхности, для анионов клеточная мембрана непроницаема в результате цитоплазма клетки оказывается заряженной отрицательно по отношению к окружающей клетку среде. Эта разность потенциалов между клеткой и внеклеточным пространством, поляризация клетки, называется мембранным потенциалом покоя (МПП).
Возникает вопрос: почему же ток ионов калия не продолжается до уравновешивания концентраций иона вне и внутри клетки? Следует вспомнить о том, это заряженная частица, следовательно, ее движение зависит и от заряда мембраны. Внутриклеточный отрицательный заряд, который создается благодаря току ионов калия из клетки, препятствует выходу из клетки новых ионов калия. Поток ионов калия прекращается, когда действие электрического поля компенсирует движение иона по градиенту концентрации. Следовательно, для данной разности концентраций ионов на мембране формируется так называемый РАВНОВЕСНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ для калия. Этот потенциал (Ek) равен RT/nF *ln Kснаружи/Kвнутри, (n – валентность иона.) или
Ek =61,5 log K снаружи / K внутри
Мембранный потенциал (МП) в большой степени зависит от равновесного потенциала калия, однако, часть ионов натрия все же проникает в покоящуюся клетку, так же, как и ионы хлора. Таким образом, отрицательный заряд, который имеет мембрана клетки, зависит от равновесных потенциалов натрия, калия и хлора и описывается уравнением Нернста. Наличие этого мембранного потенциала покоя чрезвычайно важно, потому, что именно он определяет способность клетки к возбуждению - специфическому ответу на раздражитель.
Итак, есть два факта, которые необходимо учесть, чтобы понять механизмы, поддерживающие мембранный потенциал покоя.
1 . Концентрация ионов калия в клетке значительно выше, чем во внеклеточной среде. 2 . Мембрана в покое избирательно проницаема для К + , а для Nа + проницаемость мембраны в покое незначительна. Если принять проницаемость для калия за 1, то проницаемость для натрия в покое составит лишь 0,04. Следовательно, существует постоянный поток ионов К + из цитоплазмы по градиенту концентрации . Калиевый ток из цитоплазмы создает относительный дефицит положительных зарядов на внутренней поверхности, для анионов клеточная мембрана непроницаема в результате цитоплазма клетки оказывается заряженной отрицательно по отношению к окружающей клетку среде. Эта разность потенциалов между клеткой и внеклеточным пространством, поляризация клетки, называется мембранным потенциалом покоя (МПП).
Возникает вопрос: почему же ток ионов калия не продолжается до уравновешивания концентраций иона вне и внутри клетки? Следует вспомнить о том, это заряженная частица, следовательно, ее движение зависит и от заряда мембраны. Внутриклеточный отрицательный заряд, который создается благодаря току ионов калия из клетки, препятствует выходу из клетки новых ионов калия. Поток ионов калия прекращается, когда действие электрического поля компенсирует движение иона по градиенту концентрации. Следовательно, для данной разности концентраций ионов на мембране формируется так называемый РАВНОВЕСНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ для калия. Этот потенциал (Ek) равен RT/nF *ln /, (n – валентность иона.) или
Ek=61,5 log/
Мембранный потенциал (МП) в большой степени зависит от равновесного потенциала калия, однако, часть ионов натрия все же проникает в покоящуюся клетку, так же, как и ионы хлора. Таким образом, отрицательный заряд, который имеет мембрана клетки, зависит от равновесных потенциалов натрия, калия и хлора и описывается уравнением Нернста. Наличие этого мембранного потенциала покоя чрезвычайно важно, потому, что именно он определяет способность клетки к возбуждению - специфическому ответу на раздражитель.
Возбуждение клетки
Возбуждение клетки (переход от покоя к активному состоянию) происходит при повышении проницаемости ионных каналов для натрия, а иногда и для кальция. Причиной изменения проницаемости может быть и изменение потенциала мембраны - активируются электровозбудимые каналы, и взаимодействие мембранных рецепторов с биологически активным веществом – рецептор - управляемые каналы, и механическое воздействие. В любом случае для развития возбуждения необходима начальная деполяризация - небольшое снижение отрицательного заряда мембраны, вызванная действием раздражителя. Раздражителем может быть любое изменение параметров внешней или внутренней среды организма: свет, температура, химические вещества (воздействие на вкусовые и обонятельные рецепторы), растяжение, давление. Натрий устремляется в клетку, возникает ионный ток и происходит снижение мембранного потенциала - деполяризация мембраны.
Таблица 4
Изменение мембранного потенциала при возбуждении клетки .
Обратите внимание на то, что вход натрия в клетку осуществляется по градиенту концентрации и по электрическому градиенту: концентрация натрия в клетке в 10 раз ниже, чем во внеклеточной среде и заряд по отношению к внеклеточному - отрицательный. Одновременно активируются и калиевые каналы, но натриевые (быстрые) активируются и инактивируются в течение 1 – 1,5 миллисекунд, а калиевые дольше.
Изменения мембранного потенциала принято изображать графически. На верхнем рисунке представлена начальная деполяризация мембраны - изменение потенциала в ответ на действие раздражителя. Для каждой возбудимой клетки существует особый уровень мембранного потенциала, при достижении которого резко изменяются свойства натриевых каналов. Этот потенциал назван критическим уровнем деполяризации (КУД ). При изменении мембранного потенциала до КУД открываются быстрые, потенциал зависимые натриевые каналы, поток ионов натрия устремляется в клетку. При переходе положительно заряженных ионов в клетку, в цитоплазме - увеличивается положительный заряд. В результате этого трансмембранная разность потенциалов уменьшается, значение МП снижается до 0, а затем, по мере дальнейшего поступления натрия в клетку происходит перезарядка мембраны и реверсия заряда (овершут)- теперь поверхность становится электроотрицательной по отношению к цитоплазме - мембрана ДЕПОЛЯРИЗОВАНА полностью – средний рисунок. Дальнейшего изменения заряда не происходит потому, что инактивируются натриевые каналы – больше натрий в клетку поступать не может, хотя градиент концентрации изменяется весьма незначительно. Если раздражитель обладает такой силой, что деполяризует мембрану до КУД, этот раздражитель называется пороговым, он вызывает возбуждение клетки. Точка реверса потенциала – это знак того, что вся гамма раздражителей любой модальности переведена в язык нервной системы - импульсы возбуждения. Импульсы, или потенциалы возбуждения называются потенциалами действия. Потенциал действия (ПД) – быстрое изменение мембранного потенциала в ответ на действия раздражителя пороговой силы. ПД имеет стандартные амплитуду и временные параметры, не зависящие от силы стимула - правило "ВСЕ ИЛИ НИЧЕГО". Следующий этап – восстановление мембранного потенциала покоя - реполяризация (нижний рисунок) в основном обусловлена активным ионным транспортом. Наиболее важен процесс активного транспорта - это работа Na/K - насоса, который выкачивает ионы натрия из клетки, одновременно закачивая ионы калия внутрь клетки. Восстановление мембранного потенциала происходит благодаря току ионов калия из клетки – калиевые каналы активируются и пропускают ионы калия до достижения равновесного калиевого потенциала. Это процесс важен потому, что до тех пор, пока не восстановлен МПП, клетка не способна воспринимать новый импульс возбуждения.
ГИПЕРПОЛЯРИЗАЦИЯ - кратковременное увеличение МП после его восстановления, которое обусловлено повышением проницаемости мембраны для ионов калия и хлора. Гиперполяризация бывает только после ПД и характерна далеко не для всех клеток. Попытаемся еще раз представить графически фазы потенциала действия и ионные процессы, лежащие в основе изменений потенциала мембраны (рис. 9). На оси абсцисс отложим значения мембранного потенциала в милливольтах, на оси ординат – время в миллисекундах.
1. Деполяризация мембраны до КУД – могут открыться любые натриевые каналы, иногда кальциевые, и быстрые, и медленные, и потенциал-зависимые, и рецептор-управляемые. Это зависит от вида раздражителя и типа клеток
2. Быстрое поступление натрия в клетку - открываются быстрые, потенциал-зависимые натриевые каналы, и деполяризация достигает точки реверса потенциала – происходит перезарядка мембраны, знак заряда меняется на положительный.
3. Восстановление градиента концентрации по калию – работа насоса. Калиевые каналы активированы, калий переходит из клетки во внеклеточную среду – реполяризация, начинается восстановление МПП
4. Следовая деполяризация, или отрицательный следовой потенциал - мембрана еще деполяризована относительно МПП.
5. Следовая гиперполяризация. Калиевые каналы остаются открытыми и дополнительный ток калия гиперполяризует мембрану. После этого клетка возвращается к исходному уровню МПП. Длительность ПД составляет для разных клеток от 1 до 3-4 мс.
Рисунок 9 Фазы потенциала действия
Обратите внимание на три величины потенциала, важные и постоянные для каждой клетки ее электрические характеристики.
1. МПП - электроотрицательность мембраны клетки в покое, обеспечивающая способность к возбуждению - возбудимость. На рисунке МПП = -90 мв.
2. КУД - критический уровень деполяризации (или порога генерации мембранного потенциала действия) - это такая величина мембранного потенциала, при достижении которой открываются быстрые , потенциал зависимые натриевые каналы и происходит перезарядка мембраны за счет поступления в клетку положительных ионов натрия. Чем выше электроотрицательность мембраны, тем труднее деполяризовать ее до КУД, тем менее возбудима такая клетка.
3. Точка реверса потенциала (овершут) - такая величинаположительного мембранного потенциала, при которой положительно заряженные ионы уже не проникают в клетку - кратковременный равновесный натриевый потенциал. На рисунке + 30 мв. Суммарное изменение потенциала мембраны от –90 до +30 составит для данной клетки 120 мВ, эта величина и является потенциалом действия. Если этот потенциал возник в нейроне, он будет распространяться по нервному волокну, если в мышечных клетках – будет распространяться по мембране мышечного волокна и приведет к сокращению, в железистых к секреции – к действию клетки. Это и есть специфический ответ клетки на действие раздражителя, возбуждение.
При действии раздражителя подпороговой силы возникает неполная деполяризация - ЛОКАЛЬНЫЙ ОТВЕТ (ЛО). Неполная, или частичная деполяризация – это такое изменение заряда мембраны, которое не достигает критического уровня деполяризации (КУД).
Рисунок 10. Изменение мембранного потенциала в ответ на действие раздражителя подпороговой силы - локальный ответ
Локальный ответ обладает, в основном, тем же механизмом, что и ПД, его восходящая фаза определяется входом ионов натрия, а нисходящая - выходом ионов калия. Однако амплитуда ЛО пропорциональна силе подпорогового раздражения, а не стандартна, как у ПД.
Между наружной поверхностью клетки и ее цитоплазмой в состоянии покоя существует разность потенциалов около 0,06-0,09 в, причем поверхность клетки заряжена электроположительно по отношению к цитоплазме. Эту разность потенциалов называют потенциалом покоя или мембранным потенциалом. Точное измерение потенциала покоя возможно только с помощью микроэлектродов, предназначенных для внутриклеточного отведения токов, очень мощных усилителей и чувствительных регистрирующих приборов - осциллографов.
Микроэлектрод (рис. 67, 69) представляет собой тонкий стеклянный капилляр, кончик которого имеет диаметр около 1 мкм. Этот капилляр заполняют солевым раствором, погружают в него металлический электрод и соединяют с усилителем и осциллографом (рис. 68). Как только микроэлектрод прокалывает покрывающую клетку мембрану, луч осциллографа отклоняется вниз из своего исходного положения и устанавливается на новом уровне. Это свидетельствует о наличии разности потенциалов между наружной и внутренней поверхностью клеточной мембраны.
Наиболее полно происхождение потенциала покоя объясняет так называемая мембранно-ионная теория. Согласно этой теории все клетки покрыты мембраной, имеющей неодинаковую проницаемость для различных ионов. В связи с этим внутри клетки в цитоплазме в 30-50 раз больше ионов калия, в 8-10 раз меньше ионов натрия и в 50 раз меньше ионов хлора, чем на поверхности. В состоянии покоя клеточная мембрана более проницаема для ионов калия, чем для ионов натрия. Диффузия положительно заряженных ионов калия из цитоплазмы на поверхность клетки придает наружной поверхности мембраны положительный заряд.
Таким образом, поверхность клетки в покое несет на себе положительный заряд, тогда как внутренняя сторона мембраны оказывается заряженной отрицательно за счет ионов хлора, аминокислот и других крупных органических анионов, которые через мембрану практически не проникают (рис. 70).
Потенциал действия
Если участок нервного или мышечного волокна подвергнуть действию достаточно сильного раздражителя, то в этом участке возникает возбуждение, проявляющееся в быстром колебании мембранного потенциала и называемое потенциалом действия .
Потенциал действия можно зарегистрировать либо с помощью электродов, приложенных к внешней поверхности волокна (внеклеточное отведение), либо микроэлектрода, введенного в цитоплазму (внутриклеточное отведение).
При внеклеточном отведении можно обнаружить, что поверхность возбужденного участка на очень короткий период, измеряемый тысячными долями секунды, становится заряженной электроотрицательно по отношению к покоящемуся участку.
Причина возникновения потенциала действия - изменение ионной проницаемости мембраны. При раздражении проницаемость клеточной мембраны для ионов натрия повышается. Ионы натрия стремятся внутрь клетки, так как, во-первых, они заряжены положительно и их влекут внутрь электростатические силы, во-вторых, концентрация их внутри клетки невелика. В покое клеточная мембрана была малопроницаемой для ионов натрия. Раздражение изменило проницаемость мембраны, и поток положительно заряженных ионов натрия из внешней среды клетки в цитоплазму значительно превышает поток ионов калия из клетки наружу. В результате внутренняя поверхность мембраны становится заряженной положительно, а наружная вследствие потери положительно заряженных ионов натрия отрицательно. В этот момент и регистрируется пик потенциала действия.
Повышение проницаемости мембраны для ионов натрия продолжается очень короткое время. Вслед за этим в клетке возникают восстановительные процессы, приводящие к тому, что проницаемость мембраны для ионов натрия вновь понижается, а для ионов калия возрастает. Поскольку ионы калия также заряжены положительно, то, выходя из клетки, они восстанавливают исходные отношения снаружи и внутри клетки.
Накопления ионов натрия внутри клетки при многократном возбуждении ее не происходит потому, что ионы натрия эвакуируются из нее постоянно за счет действия специального биохимического механизма, называемого "натриевым насосом". Есть данные и об активном транспорте ионов калия с помощью "натрий-калиевого насоса".
Таким образом, согласно мембранно-ионной теории в происхождении биоэлектрических явлений решающее значение имеет избирательная проницаемость клеточной мембраны, обусловливающая разный ионный состав на поверхности и внутри клетки, а следовательно, и разный заряд этих поверхностей. Следует заметить, что многие положения мембранно-ионной теории все еще дискуссионны и нуждаются в дальнейшей разработке.