Sve žive ćelije reaguju na povišenu temperaturu i neke druge stresore sintezom specifičnog skupa proteina koji se nazivaju proteini toplotnog šoka (HSP, protein toplotnog šoka, protein stresa). Određeni broj bakterija je pokazao univerzalni adaptivni odgovor kao odgovor na različite stresne utjecaje (visoke i niske temperature, oštre promjene pH vrijednosti itd.), koji se očituje u intenzivnoj sintezi male grupe sličnih proteina. Takvi proteini se nazivaju proteini toplotnog šoka, a sam fenomen se naziva sindrom toplotnog šoka. Stresno djelovanje na bakterijsku ćeliju uzrokuje inhibiciju sinteze normalnih proteina, ali inducira sintezu male grupe proteina čija je funkcija vjerojatno da suzbija efekte stresa štiteći najvažnije stanične strukture, prvenstveno nukleoide i membrane. Regulatorni mehanizmi koji se pokreću u ćeliji pod uticajima koji izazivaju sindrom toplotnog šoka još nisu jasni, ali je očigledno da se radi o univerzalnom mehanizmu nespecifičnih adaptivnih modifikacija.
Kao što je već spomenuto, HSP uključuju proteine koje sintetiziraju stanice kao odgovor na toplotni šok, kada je ekspresija glavnog skupa proteina uključenih u normalan metabolizam potisnuta. Porodica 70 kDa HSP (HSP-70 eukariota i DnaK prokariota) uključuje proteine toplotnog šoka koji igraju značajnu ulogu kako u osiguravanju opstanka ćelija u uslovima stresa tako iu normalnom metabolizmu. Nivo homologije između prokariotskih i eukariotskih proteina prelazi 50% sa potpunim identitetom pojedinačnih domena. 70 kDa HSP-ovi su jedna od najkonzerviranijih grupa proteina u prirodi (Lindquist Craig, 1988; Yura et al., 1993), što je vjerovatno zbog funkcija pratioca koje ovi HSP-ovi obavljaju u stanicama.
Indukcija gena proteina toplotnog šoka (HSP) kod eukariota nastaje pod uticajem faktora toplotnog šoka HSF. U ćelijama bez stresa, HSF je prisutan i u citoplazmi i u jezgru kao monomerni oblik povezan sa Hsp70 i nema aktivnost vezanja DNK. Kao odgovor na toplotni šok ili drugi stres, Hsp70 se odvaja od HSF-a i počinje savijati denaturirane proteine. HSF se sastavlja u trimere, razvija aktivnost vezivanja DNK, akumulira se u jezgru i veže se za promotor. U ovom slučaju, transkripcija pratioca u ćeliji se višestruko povećava. Nakon što stres prođe, oslobođeni Hsp70 se ponovo pridružuje HSF-u, koji gubi svoju aktivnost vezanja DNK i sve se vraća u normalu [Morimoto ea 1993. se pojavljuju na površini sinovijalnih ćelija tokom bakterijskih infekcija.
Većina ovih proteina toplotnog šoka nastaje kao odgovor na druge štetne podražaje. Možda pomažu ćeliji da preživi stresne situacije. Postoje tri glavne porodice proteina toplotnog šoka - porodice proteina sa mol. težine 25, 70 i 90 kDa (hsp25, hsp70 i hsp90. U normalnim ćelijama pronađeno je mnogo veoma sličnih proteina iz svake od ovih porodica. Oni pomažu da se dovedu u rastvor i ponovo savijaju denaturisani ili pogrešno savijeni proteini. Takođe imaju i druge funkcije.
Proteini iz porodice hsp70 su najbolje proučeni. Ovi proteini se vezuju za neke druge proteine, kao i za abnormalne proteinske komplekse i agregate, iz kojih se zatim oslobađaju vezivanjem ATP-a. Oni pomažu u rastvaranju i ponovnom savijanju agregiranih ili pogrešno savijenih proteina kroz više ciklusa dodavanja i hidrolize ATP-a. Abnormalni proteini su prisutni u svakoj ćeliji, ali pod određenim uslovima, kao što je toplotni šok, njihov broj u ćeliji se naglo povećava, a shodno tome postoji potreba za velikim brojem proteina toplotnog šoka. To se osigurava aktivacijom transkripcije određenih gena toplotnog šoka.
Proteini toplotnog šoka, formirajući kompleks sa rastućim polipeptidnim lancem, sprečavaju njegovu nespecifičnu agregaciju i degradaciju od delovanja intracelularnih proteinaza, promovišući pravilno savijanje blokova koje se dešava uz učešće drugih pratilaca. Hsp70 učestvuje u ATP-zavisnom odvijanju polipeptidnih lanaca, čineći nepolarne regione polipeptidnih lanaca dostupnim delovanju proteolitičkih enzima.
Proteini toplotnog šoka kodirani su familijom evolucijski stabilnih gena koji se eksprimiraju kao odgovor na različite stresne uvjete i uključeni su u mehanizme adaptacije. Prvi put otkriveni tokom termičkog šoka kod Drosophile, proteini stresa su uključeni u većinu fizioloških procesa svih živih organizama i komponenta su jednog signalnog mehanizma [Ananthan J., Goldberg A.L. 1986, Massa S.M., Swanson R.A. 1996, Morimoto R., Tissieres A. 1994, Ritossa F. 1962].
Aktivacija transkripcionih faktora stresnih proteina (HSF) nastaje njihovom fosforilacijom pod uticajem povećanja intracelularne koncentracije kalcijuma, reakcija slobodnih radikala lipidne peroksidacije i drugih procesa oksidativnog stresa, aktivacije inhibitora proteaze i tirozin kinaza. Ali glavni okidač koji pokreće sintezu proteina stresa je nedostatak ATP-a, koji prati nedovoljnu opskrbu moždanog tkiva kisikom i glukozom [Benjamin I.J., Hone S. 1992, Bruce J.L., Price B.D. 1993, Cajone F., Salina M. 1989, Courgeon A.-M., Rollet E. 1988, Freeman M.L., Borrelli M.J. 1995, Kil H.Y., Zhang J. 1996, Suga S., Novak T.S., Jr. 1998, Price B.D., Calderwood S.K. 1991, Zhou M., Wu X. 1996].
Postoji nekoliko klasa faktora transkripcije proteina stresa, među kojima je protein HSF1 posrednik odgovora na stres, a protein HSF2 je regulator hsp gena. U uslovima cerebralne ishemije, HSF1 i HSF2 sinergistički aktiviraju transkripciju gena. Oni formiraju aktivirane trimere koji se vezuju za regulatorne sekvence (HSE) u promotorskim regionima gena za stres, što dovodi do sinteze mRNA. Akumulacija proteina stresa dovodi do „uključenja” autoregulatorne petlje, što prekida njihovu dalju ekspresiju [Baler R., Zou J. 1996, Mesril R., Ch, S.-H. 1994, Sistonen L, Sarge K.D. 1994, Rabindran S.K., Haroun R.I. 1993, Sarge K.D., Murphy S. 1993, Sorger P.K., Pelham H.R.B. 1987, Wu C., Wilson S. 1987, Nakai A., Morimoto R. 1993, Nowak T.S., Jacewicz M. 1994, Scharf K.-D., Rose S. 1990, Schuetz T.J., Gallo G.J. 1991].
U eksperimentalnim modelima sa fokalnom cerebralnom ishemijom, ustanovljeno je da se ekspresija gena za glavni protein stresa, protein HSP72, bilježi u ograničenom području mozga sa nivoom smanjenja cerebralnog krvotoka ispod 50 % normalnog i samo u ćelijama koje ostaju održive. Shodno tome, u nuklearnoj zoni ishemije, ekspresija hsp72 gena se uočava pretežno u vaskularnim endotelnim ćelijama, koje su otpornije na ishemiju; u marginalnom području infarkta - i u glijalnim stanicama, u zoni penumbre - i u neuronima [
Pacijenti mogu dobiti genetski modifikovan lijek za sve vrste i stadijume malignih tumora za tri do četiri godine
U Državnom istraživačkom institutu za visoko čiste lijekove Federalne medicinsko-biološke agencije (FMBA) Rusije završavaju se pretklinička ispitivanja proteina toplotnog šoka, lijeka koji bi mogao revolucionirati onkologiju. Ovo je fundamentalno novi lijek za liječenje malignih tumora, dobijen biotehnologijom. Naučnici sugeriraju da će pomoći ljudima s tumorima koji su trenutno neizlječivi. Uspjeh u stvaranju lijeka postignut je uz pomoć svemirskog eksperimenta. Zamjenik direktora Instituta za naučni rad, dopisni član Ruske akademije nauka, doktor medicinskih nauka, profesor Andrej Simbircev rekao je o tome dopisniku Izvestija Valeriji Nodelman.
- Koji je glavni aktivni sastojak novog lijeka za maligne tumore?
Naš lijek ima radni naziv "Protein toplotnog šoka" - baziran na glavnom aktivnom sastojku. Ovo je molekul koji sintetizira bilo koja stanica ljudskog tijela kao odgovor na različite stresore. Naučnici su odavno znali za njegovo postojanje. U početku se pretpostavljalo da protein može samo zaštititi ćeliju od oštećenja. Kasnije se ispostavilo da osim toga ima i jedinstveno svojstvo - pomaže ćeliji da pokaže svoje tumorske antigene imunološkom sistemu i time pojačava antitumorski imuni odgovor.
- Ako tijelo proizvodi takve molekule, zašto ne može samo da se nosi sa rakom?
Zato što je količina ovog proteina u tijelu minimalna. Nije dovoljno da se postigne terapeutski efekat. Također je nemoguće jednostavno uzeti ove molekule iz zdravih stanica i uvesti ih u bolesne. Stoga je razvijena posebna biotehnologija za sintetizaciju proteina u količini potrebnoj za stvaranje lijeka. Izolirali smo gen ljudske ćelije koji je odgovoran za proizvodnju proteina i klonirali ga. Tada je stvoren soj proizvođača i bakterijska ćelija je bila prisiljena da sintetizira ljudski protein. Takve ćelije se dobro razmnožavaju, što nam je omogućilo da dobijemo neograničenu količinu proteina.
- Vaš izum je da kreirate tehnologiju za proizvodnju “proteina toplotnog šoka”?
Ne samo. Također smo uspjeli proučiti njegovu strukturu i dešifrirati mehanizam antitumorskog djelovanja na molekularnom nivou. FMBA ima jedinstvenu priliku da sprovodi medicinska istraživanja koristeći svemirske programe. Činjenica je da je za analizu djelovanja proteina rendgenskom difrakcijom potrebno od njega formirati ultra čisti kristal. Međutim, nemoguće ga je dobiti u uvjetima gravitacije - proteinski kristali rastu neravnomjerno. Rodila se ideja da se kristali uzgajaju u svemiru. Takav eksperiment izveden je 2015. Upakovali smo ultra-čisti protein u kapilarne epruvete i poslali ih na ISS. Tokom šest mjeseci leta, savršeni kristali su se formirali u cijevima. Spušteni su na zemlju i analizirani u Rusiji i Japanu (imaju tešku opremu za rendgensku analizu).
- Da li je efikasnost leka već dokazana?
Proveli smo eksperimente na miševima i štakorima koji su razvili melanome i sarkome. Tok primjene lijeka je u većini slučajeva doveo do potpunog izlječenja čak iu kasnijim fazama. Odnosno, već sada možemo sa sigurnošću reći da protein ima biološku aktivnost potrebnu za liječenje raka.
Zašto mislite da će protein toplotnog šoka pomoći ne samo kod sarkoma, već i kod drugih vrsta malignih tumora?
Novi lijek je baziran na molekuli koju sintetiziraju sve vrste stanica. Ona nema specifičnosti. Lijek će djelovati na druge vrste tumora zbog ove svestranosti.
- Hoće li biti potrebno svaki put poslati protein u svemir za stvaranje lijeka?
br. Stvaranje kristala u nultoj gravitaciji bilo je potrebno samo za naučnu fazu razvoja lijeka. Svemirski eksperiment je samo potvrdio da smo na dobrom putu. A proizvodnja će biti isključivo zemaljska. U stvari, mi već proizvodimo lijek na proizvodnim mjestima istraživačkog instituta. To je proteinski rastvor koji se može davati pacijentima. Ubrizgavamo ga intravenozno miševima. Ali možda ćemo tokom kliničkih ispitivanja pronaći efikasnije pristupe - na primjer, ciljana isporuka proteina tumoru može se pokazati kao optimalna.
- Da li novi lijek ima nuspojave?
Do sada nisu identifikovani problemi. Tokom testiranja, protein toplotnog šoka nije pokazao toksičnost. No, zaključak o potpunoj sigurnosti lijeka konačno ćemo moći izvući tek nakon završetka pretkliničkih studija. Ovo će trajati još godinu dana.
- I onda možete započeti klinička ispitivanja?
U potpunosti zavisi od toga da li možemo pronaći izvor finansiranja za njih. Za pretkliničku fazu dobili smo grant od Ministarstva prosvjete i nauke. Klinička ispitivanja su veoma skupa - oko 100 miliona rubalja. Obično se sprovode pod uslovima sufinansiranja: postoji privatni investitor koji ulaže sredstva, a država vraća 50% u slučaju uspešnog završetka. Računamo na podršku Ministarstva industrije i trgovine ili Ministarstva zdravlja.
-Da li je već pronađen privatni investitor?
br. Pred nama je puno posla da ga pronađemo. Bilo bi moguće pozvati Japance da budu investitori, ali ja bih da počnem od Rusije, jer je to domaći razvoj. Pokucaćemo na sva vrata, jer je lek jedinstven. Na pragu smo otkrivanja potpuno novog liječenja raka. Pomoći će ljudima sa neizlječivim tumorima.
- Da li se slična dešavanja provode u inostranstvu?
Čuli smo o pokušajima nabavke lijeka "Heat Shock Protein" u različitim zemljama. Takav rad se obavlja, na primjer, u SAD-u i Japanu. Ali do sada niko nije objavio njihove rezultate. Nadam se da smo sada ispred naših stranih kolega po ovom pitanju. Glavna stvar je ne stati na ovom putu. A to se može dogoditi samo iz jednog razloga – zbog nedostatka sredstava.
- Kada će realno, pod svim povoljnim okolnostima, čovečanstvo moći da dobije lek za rak?
Potpuna klinička ispitivanja obično traju dvije do tri godine. Nažalost, neće raditi brže - ovo je ozbiljna studija. Odnosno, uzimajući u obzir završnu fazu pretkliničkih studija, pacijenti će dobiti novi lijek za tri do četiri godine.
10.11.2018
Strukturne i funkcionalne promjene pod utjecajem visokih temperatura. Izlaganje visokim temperaturama prvenstveno utiče na fluidnost membrana, što rezultira povećanjem njihove permeabilnosti i oslobađanjem supstanci rastvorljivih u vodi iz ćelije. Kao rezultat, dolazi do dezorganizacije mnogih ćelijskih funkcija, posebno do njihove podjele. Dakle, ako na temperaturi od 20 °C sve ćelije prolaze kroz proces mitotičke diobe, na 38 °C - svaka sedma ćelija, a na 42 °C - samo svaka petstota ćelija.
Povećana fluidnost membranskih lipida, uzrokovana promjenama u sastavu i strukturi membrane tokom pregrijavanja, dovodi do gubitka aktivnosti enzima vezanih za membranu i poremećaja ETC aktivnosti. Od glavnih procesa proizvodnje energije - fotosinteze i disanja, ETC fotosinteze je najosetljiviji, posebno fotosistem II (PS II). Što se tiče enzima fotosinteze, glavni enzim fotosinteznog ciklusa C3, RuBP karboksilaza, prilično je otporan na pregrijavanje.
Pregrijavanje ima primjetan učinak na vodni režim biljke, brzo i značajno povećavajući brzinu transpiracije. Kao rezultat toga, biljka doživljava nedostatak vode. Kombinacija suše sa toplotom i velikom sunčevom insolacijom ima najveći negativan uticaj na useve, remeteći, uz fotosintezu, disanje i vodni režim, i apsorpciju mineralnih elemenata ishrane.
Molekularni aspekti oštećenja toplotnog šoka. Toplota prvenstveno oštećuje proteine u ćeliji, posebno enzime, remeteći proces de novo biosinteze proteina, inhibirajući aktivnost enzima i izazivajući degradaciju postojećih proteina. Kao rezultat toga, skupovi enzima koji su važni za funkcionisanje ćelija i tokom perioda stresa i naknadne popravke mogu nestati. Većina ključnih biljnih enzima je termolabilna, uključujući Rubisco, katalazu i SOD. Rubisco inhibicija je glavni razlog za smanjenje IF na visokoj temperaturi. Toplota takođe inhibira sposobnost pretvaranja saharoze u skrob u ječmu, pšenici i krompiru, što ukazuje da je jedan ili više enzima u lancu konverzije snažno inhibirano toplotom. Direktan uticaj toplote na aktivnost rastvorljive skrob sintaze u endospermu pšenice, kako in vitro tako i in vivo, izaziva supresiju akumulacije skroba.
Visoke temperature inhibiraju aktivnost katalaze kod nekoliko biljnih vrsta, dok aktivnost drugih antioksidativnih enzima nije inhibirana. Kod raži su promjene aktivnosti katalaze bile reverzibilne i nisu ostavljale vidljiva oštećenja nakon prestanka topline, dok je kod krastavca oporavak aktivnosti katalaze bio usporen (inhibiran) i praćen promjenom boje hlorofila, što ukazuje na značajnije oksidativno oštećenje. Kod sadnica kukuruza uzgojenih na povišenim temperaturama (35°C), aktivnost SOD je bila niža nego na relativno niskim temperaturama (10°C).
Toplota je poremetila integritet membrana, što je dovelo do njihove povećane propusnosti za jone i rastvore. Istovremeno je poremećena aktivnost membranskih enzima fotosinteze, disanja i transporta asimilata. Toplota je povećala stepen zasićenosti masnih kiselina u membranskim fosfolipidima ER. U uslovima ekstremne vrućine, njegove membrane su selektivno oštećene, uzrokujući degradaciju mRNK (3-amilaze. Istovremeno, toplotno indukovano curenje supstanci kroz membrane utiče na redoks potencijal glavnih ćelijskih kompartmana, koji zauzvrat, remeti tok metaboličkih procesa sve do smrti ćelije.
Oksidativni stres je nedavno prepoznat kao jedan od najvažnijih negativnih učinaka topline na biljke. Toplina uzrokuje neravnotežu između količine sunčevog zračenja koje apsorbiraju pigmenti i transporta elektrona kroz citokrome, proces koji se naziva fotoinhibicija. Višak energije može se prenijeti na kisik, što dovodi do stvaranja ROS. Glavna područja oksidativnog oštećenja u stanicama su mitohondriji i hloroplasti, gdje je poremećen transport elektrona. U hloroplastima stres visoke temperature uzrokuje fotoinhibiciju fotosinteze i inaktivaciju katalaze, što dovodi do nakupljanja ROS-a i izbjeljivanja klorofila. Fotosistem II je prepoznat kao najosetljiviji na toplotu, što dovodi do raspada funkcionalnih komponenti kompleksa PS II i, shodno tome, poremećaja transporta elektrona između PS I i PS II, povećanja protoka elektrona do molekularnog kiseonika i formiranje ROS-a. Kao rezultat toga, FI se smanjuje, što je glavni uzrok gubitka usjeva zbog topline.
Proteini toplotnog šoka. Sinteza proteina toplotnog šoka (HSP) kao odgovor na povišenu temperaturu otkrivena je 1974. godine. Karakteristična je za sve vrste živih organizama, uključujući više i niže biljke. HSP u svim organizmima je predstavljen velikim skupom polipeptida, koji se obično nazivaju prema njihovoj molekularnoj težini, izraženoj u kilodaltonima (kDa). Na primjer, HSP sa molekulskom težinom od 70 kDa naziva se HSP 70. Na značajnu ulogu HSP u životu ćelija ukazuje visoka očuvanost njihove evolucije. Dakle, pojedinačne regije u evoluciji HSP 70 zadržavaju preko 90% homologije kod bakterija i ljudi. Biljni HSP su predstavljeni grupom proteina visoke molekularne težine (110-60 kDa) i niske molekularne težine (35-15 kDa). Posebne karakteristike biljaka su mnoštvo HSP niske molekularne težine i visok intenzitet njihove sinteze tokom toplotnog šoka (HS).
Sinteza HSP je stresni program koji se pokreće toplotnim šokom i događa se kada temperatura poraste 8-10 °C iznad normalne. Tako se u listovima ječma maksimalna sinteza HSP-a postiže na 40 °C, a u listovima pirinča - na 45 °C. Prebacivanje normalnog života ćelije na stresni program uključuje reprogramiranje genoma povezano sa inhibicijom ekspresije gena čija je aktivnost karakteristična za život u normalnim uslovima i aktivacijom TS gena. U biljnim ćelijama, mRNA koja kodira HSP se otkriva 5 minuta nakon početka stresa. Osim toga, dolazi do raspada polisoma koji sintetiziraju proteine tipične za normalna stanja i formiranja polisoma koji sintetiziraju HSP. Brza aktivacija sinteze HSP-a na nivou ne samo transkripcije (sinteza RNK na DNK), već i translacije (sinteza proteina na mRNA) postiže se kao rezultat koordinacije mnogih događaja. Toplotni šok uzrokuje promjene u mRNA sintetiziranoj u ćeliji prije šoka, povezane s modifikacijom faktora translacije proteina i ribosomskih proteina. Osim toga, HSP mRNA se razlikuju od mRNA običnih proteina. Kao rezultat HS, sinteza konvencionalnih proteina je oslabljena, a zatim zaustavljena i aparat za sintezu proteina prelazi na sintezu HSP-a, koji se detektiraju u ćeliji već 15 minuta nakon početka HS. Maksimalna sinteza se opaža nakon 2-4 sata, a zatim se smanjuje.
Sinteza različitih HSP-a odvija se na različitim temperaturama. U hloroplastima, sinteza HSP visoke molekularne težine aktivirana je u rasponu od 34-42 °C, oslabljena na 44 °C, a naglo smanjena na 46 °C. Indukcija sinteze HSP niske molekularne mase bila je posebno uočljiva na 40-42 °C. Značajna inhibicija Rubisco sinteze dogodila se samo na temperaturama iznad 44 °C. Gotovo svi otkriveni HSP-ovi hloroplasta su kodirani u jezgru, sintetizirani u citoplazmi, a zatim transportirani u hloroplast, gdje obavljaju zaštitnu funkciju tokom HS. Nakon završetka toplotnog šoka, sinteza HSP se zaustavlja i nastavlja se sinteza proteina karakterističnih za ćeliju u normalnim temperaturnim uvjetima. U ovom slučaju, HSP mRNA se brzo uništava u stanicama na normalnim temperaturama, dok sami proteini mogu opstati mnogo duže, očito osiguravajući povećanje otpornosti stanice na toplinu. Produžena izloženost ćelija HSP uslovima obično takođe dovodi do slabljenja i prestanka sinteze HSP. U ovom slučaju, mehanizmi regulacije ekspresije HSP gena se aktiviraju prema principu povratne sprege. Akumulacija HSP-a u ćelijama smanjuje aktivnost njihovih gena. Možda na taj način ćelija održava količinu HSP-a na potrebnom nivou, sprečavajući njihovu prekomernu proizvodnju.
U pravilu, kao odgovor na povećanje temperature, sintetiziraju se odgovarajući proteini, što pomaže u povećanju toplinske otpornosti tijela. Zaštitna uloga HSP-a opisana je modelom molekularnog pratioca (u prijevodu s engleskog - vodič, mentor mladoj osobi). U ekstremnim uslovima, HSP „čuvaju“ funkcionisanje specifičnih makromolekula i ćelijskih struktura, oslobađajući ćelije od oštećenih komponenti, što omogućava održavanje ćelijske homeostaze. Interakcija HSP 70 sa drugim proteinima zavisi od odnosa ATP/ADP. Vjeruje se da HSP 70, u kompleksu sa ADP, zadržava netkani protein, a zamjena ADP sa ATP dovodi do oslobađanja ovog proteina iz kompleksa sa HSP 70.
U skladu sa ovim modelom, HSP povećavaju termičku stabilnost ćelija, obezbeđujući sledeće procese: energetski zavisnu stabilizaciju prirodne strukture proteina; pravilno sklapanje oligomernih struktura u uslovima hipertermije; transport tvari kroz membrane organela; dezagregacija neispravno sastavljenih makromolekularnih kompleksa; oslobađanje ćelije od denaturiranih makromolekula i recikliranje monomera koji su u njima uključeni uz pomoć ubikvitina. Ubikvitini su proteini toplotnog šoka niske molekularne težine, čije vezivanje za polipeptid čini ga metom za proteaze. Ovo je neka vrsta "smrtnog traga" za proteine. Uz njihovu pomoć odstranjuju se i uklanjaju proteini koji su oštećeni i nedovršeni kao rezultat djelovanja HS.
Brojne činjenice podržavaju zaštitnu funkciju HSP u HS. Posebno se pokazalo da isključivanje sinteze proteina sa specifičnim inhibitorima tokom HS, kada dođe do sinteze HSP, dovodi do smrti ćelije. Ćelije se mogu očvrsnuti, povećavajući njihovu termičku stabilnost tako što se prvo kratko izlažu povišenim temperaturama. Uslovi za takvo stvrdnjavanje poklapaju se sa uslovima za izazivanje sinteze HSP. Zanimljivo je da sintezu HSP-a u biljkama induciraju ne samo HSP-ovi, već i, na primjer, kadmijuve soli i arsenit, tretman kojim se povećava otpornost stanica na toplinu. Također je važno naglasiti da promjene u strukturi gena (mutacije) koje remete sintezu HSP dovode do gubitka otpornosti ćelije na zagrijavanje. Dalja istraživanja specifične funkcije svakog HSP-a pod stresom će omogućiti da se razjasne molekularni mehanizmi formiranja i funkcionisanja zaštitnih svojstava tokom HSP-a.
Većina HS proteina ima srodne proteine u ćelijama, koji se sintetiziraju na normalnim temperaturama stalno ili tokom određenih faza ontogeneze. Ispostavilo se da se ovi proteini, posebno HSP 70, vežu za druge proteine, uzrokujući njihovo odvijanje i sprečavajući njihovu agregaciju. Ovo posljednje može spriječiti protein da stekne nativnu konformaciju neophodnu za njegovu funkcionalnu aktivnost. Razmatranje proteina pomoću HSP-a neophodno je za njihovo prodiranje kroz membranu hloroplasta, mitohondrija i ER. Budući da se agregacija proteina naglo povećava s povećanjem temperature, aktivacija sinteze HSP 70 u ovim uvjetima treba zaštititi proteine od nepovratnih oštećenja. HSP su prisutni u svim ćelijskim odjeljcima, posebno u jezgru i nukleolima, gdje se akumuliraju tokom HS. HSP 70 podstiče prolaz prekursora hloroplasta i mitohondrijalnih proteina sintetizovanih u citoplazmi kroz membranu, igrajući ulogu u biogenezi ovih organela. HSP 60, koji se takođe odnosi na šaperone, takođe se naziva šaperonini. Ovi proteini osiguravaju ispravan sklop kvartarne strukture ćelijskih proteina, kao što je ključni fotosintetski enzim Rubisco, koji se sastoji od osam velikih i osam malih podjedinica. U grupu šaperona spada i HSP 90, koji igra važnu ulogu u formiranju kompleksa steroidnih hormona sa njihovim receptorima. Osim toga, HSP 90 formira komplekse s nekim protein kinazama, kontrolirajući njihovu aktivnost. Poznato je da protein kinaze fosforiliraju različite ćelijske proteine, regulišući njihovu aktivnost.
Više od 30 HSP niske molekularne težine (15-35 kDa) pronađeno je u biljkama, lokalizovanih uglavnom u citoplazmatskim granulama toplotnog šoka koje se pojavljuju tokom HS i nestaju nakon njega. Njihova glavna funkcija je zaštita mRNA prije šoka, što im omogućava da se koriste za sintezu proteina nakon završetka šoka. HSP niske molekularne težine se također nalaze u drugim dijelovima, posebno u hloroplastima. Vjeruje se da štite tilakoidne membrane, gdje su lokalizirani procesi svjetlosne faze fotosinteze, od HS.
U nekim biljkama otkrivena je konstitutivna (neindukovana) sinteza HSP-a tokom formiranja, posebno polena. Moguće je da HSP pred šokom osiguravaju njegovu termičku stabilnost tokom HS. Pored HSP-a, toplota indukuje ekspresiju drugih klasa proteina, posebno kalmodulina.
Metabolizam u uslovima toplotnog šoka. Vrlo je malo ciljanih studija metabolizma biljaka pod utjecajem HS, a u tim eksperimentima i HS i suša često su djelovali istovremeno. Ovo je vrlo važna stvar, budući da je odgovor biljaka na kombinaciju suše i HS različit od odgovora na pojedinačne stresore. Dakle, pod kombinacijom stresa, biljke su akumulirale nekoliko topljivih šećera, uključujući saharozu, maltozu, trekalozu, fruktozu i glukozu. Pod uticajem suše dolazi do akumulacije prolina, ali se pod uticajem HS, kao i kombinacijom HS i suše, prolin nije akumulirao u biljkama. U uslovima HS, prolin ili njegov intermedijer (pirolin-5-karboksilat) je toksičan, tako da prolin nije prikladan kao kompatibilan osmolit. Uz istodobno djelovanje HS i suše, sadržaj glutamina naglo raste. Očigledno, kada je biosinteza prolina inhibirana, glutamat se transformiše u glutamin. Istovremeno se aktiviraju geni koji kodiraju razgradnju škroba i biosintezu lipida, a povećava se i ekspresija gena koji kodiraju heksokinazu, glukozo-6-fosfat dehidrogenazu, fruktokinazu i saharozu-UDP-glukoziltransferazu. Upravo promjene u ekspresiji gena na nivou transkripcije predstavljaju glavni faktor u reprogramiranju metabolizma ugljikohidrata.
Pod uticajem HS na sadnice Arabidopsis ustanovljeno je sinhrono povećanje veličine pulova niza aminokiselina i amida (asparagin, leucin, izoleucin, treonin, alanin i valin) dobijenih iz AP i PVA. Osim toga, povećan je sadržaj ugljikohidrata: maltoze, saharoze, galaktinola, mioinozitola, rafinoze i monosaharida, prekursora ćelijskog zida. Već nakon 6 sati povećane su koncentracije b-alanina, glicerola, maltoze, saharoze i trekaloze.
Fotosinteza, transpiracija i disanje. Indikator koji je usko povezan sa regulacijom metabolizma CO2 i H2O u biljkama je stomatalna provodljivost. Opsežni dokazi sugeriraju da visoke temperature izazivaju zatvaranje stomata, što se može posmatrati kao indirektan odgovor na temperaturnu ovisnost deficita pritiska vodene pare i disanja listova. Dakle, djelomično zatvaranje stomata je posljedica povećanja intracelularne koncentracije CO2. Međutim, željeno zatvaranje stomata ne dovodi do smanjenja fotosinteze, jer se temperaturne ovisnosti stomatalne provodljivosti i IF ne poklapaju. Stoga se provodljivost stomata povećava na temperaturama gdje je fotosinteza nepovratno inhibirana.
Iako se čini da stomatalna provodljivost ne utječe direktno na IF, ona pomaže u regulaciji transpiracije, koja kontroliranjem temperature listova utječe na toplotnu toleranciju fotosinteze. U usjevima nekih usjeva, sa dovoljnom vlagom, temperatura zraka zbog termoregulacije može biti skoro 8 °C niža od temperature zraka iznad usjeva. Istovremeno, kada postoji manjak vlage u zemljištu, može se uočiti suprotna slika - temperatura listova u usjevu premašuje temperaturu okolnog zraka za skoro 15 °C, što pojačava negativan uticaj nedostatka vode na IF.
Stopa neto fotosinteze pšenice i većine C3 useva je prilično stabilna u rasponu od 15-30 °C. Ispod i iznad ovog temperaturnog raspona, IF se smanjuje za 5-10% za svaki stepen (slika 3.1). Relativno mala promjena neto fotosinteze u rasponu od 15-30 °C ne bi trebala sakriti činjenicu da se bruto fotosinteza zapravo povećava s povećanjem temperature. Međutim, zbog istovremenog povećanja ID-a cijele biljke, a posebno fotorespiracije, intenzitet neto fotosinteze se malo mijenja.
Primjetne su razlike između C3 i C4 usjeva u tom pogledu, pri čemu je optimalan intenzitet neto fotosinteze kod C4 vrsta uočen na višim temperaturama (30-40 °C). Njihova fotorespiracija je beznačajna, zbog čega povećanje fiksacije CO2 s porastom temperature nije maskirano fotorespiratornim troškovima. Zaista, viši temperaturni optimum za neto fotosintezu kod C4 vrsta u poređenju sa C3 vrstama objašnjava se nižim respiratornim troškovima na povišenim temperaturama u prvim vrstama. Nepovratne promjene u njihovom fotosintetskom aparatu uočavaju se tek kada temperatura pređe 40 °C, uglavnom zbog oštećenja PS II koje nastaje u roku od nekoliko minuta nakon početka djelovanja HS, što presudno utiče na prinos.