Kako izvršiti PCR analizu: opis postupka. Polimerazna lančana reakcija PCR reakcija šta

Lančana reakcija polimeraze (PCR)- eksperimentalna metoda molekularne biologije, koja je specifična amplifikacija nukleinskih kiselina inducirana sintetičkim oligonukleotidnim prajmerima in vitro.

Ideja o razvoju PCR metode pripada američkom istraživaču Kary Mullis, koji je 1983. godine stvorio metodu koja je omogućila amplificiranje DNK tokom cikličkih duplikacija pomoću enzima DNK polimeraze u umjetnim uvjetima. Nekoliko godina nakon objavljivanja ove ideje, 1993. godine, K. Mullis je za nju dobio Nobelovu nagradu.

Na početku primjene metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcionu smjesu je bilo potrebno dodati DNK polimerazu, jer se na visokim temperaturama brzo inaktivira. Procedura je bila vrlo neefikasna i zahtijevala je mnogo vremena i enzima. Godine 1986. značajno je modificiran korištenjem DNK polimeraze iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi su sposobni da izdrže mnoge reakcione cikluse, što omogućava automatizaciju PCR-a. Jedna od najčešće korištenih termostabilnih DNK polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticus i imenovan Taq-DNK polimeraza.

Suština metode. Metoda se zasniva na ponovljenom selektivnom kopiranju određenog dijela DNK pomoću enzima Taq DNK polimeraze. Lančana reakcija polimeraze omogućava dobijanje pojačala dužine do nekoliko hiljada parova baza. Da bi se povećala dužina PCR proizvoda na 20-40 hiljada parova baza, koristi se mješavina različitih polimeraza, ali to je još uvijek znatno manje od dužine kromosomske DNK eukariotske ćelije.

Reakcija se odvija u programabilnom termostatu (pojačivaču) - uređaju koji se može izvesti prilično brzo

hlađenje i zagrevanje epruveta (obično sa tačnošću od najmanje 0,1 °C). Pojačala vam omogućavaju postavljanje složenih programa, uključujući mogućnost "hot starta" i naknadnog skladištenja. Za PCR u realnom vremenu proizvode se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Postoje i uređaji sa automatskim poklopcem i pregradom za mikroploče, što im omogućava da se integrišu u automatizovane sisteme.

Obično se pri izvođenju PCR-a izvodi 20-45 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze: denaturacija, žarenje prajmera, elongacija (sl. 6.1 i 6.2). Na sl. Slika 6.1 prikazuje dinamiku promjena temperature u epruveti tokom PCR ciklusa.

Rice. 6.1. Grafikon promjena temperature u epruveti tokom jednog ciklusa lančane reakcije polimeraze

Denaturacija DNK šablona se provodi zagrijavanjem reakcione smjese na 94-96 °C u trajanju od 5-90 s tako da se lanci DNK razdvoje. Treba napomenuti da se prije prvog ciklusa reakcijska smjesa prethodno zagrijava 2-5 minuta kako bi se u potpunosti denaturirala početna matrica, što omogućava smanjenje količine nespecifičnih produkta reakcije.

Rice. 6.2.Šema prvog kruga polimerazne lančane reakcije

Faza žarenja prajmera. Uz postepeno smanjenje temperature, prajmeri se komplementarno vezuju za matriks. Temperatura žarenja zavisi od sastava prajmera i obično je 4-5° niža od izračunate temperature topljenja. Trajanje etape je 5-60 s.

Tokom sledeće faze - izduženje- sinteza ćerke DNK lanca se dešava na matičnom matriksu. Temperatura elongacije zavisi od polimeraze. Obično korištene DNK polimeraze Taq i Pfu su najaktivnije na 72°C. Vrijeme elongacije, koje uglavnom ovisi o dužini PCR proizvoda, je tipično 1 min na hiljadu parova baza.

Lančana reakcija polimeraze poznata je već 30 godina. Široko se koristi u mnogim poljima, od arheologije do genetike.

Upravo PCR metoda pomaže u utvrđivanju očinstva, ali se najčešće koristi za identifikaciju različitih zaraznih bolesti u ljudskom tijelu.

Kako se radi PCR analiza i šta je to? Pokušat ćemo detaljno odgovoriti na ova pitanja.

PCR analiza - šta je to?

Polimerazna lančana reakcija (PCR) je visokoprecizna molekularno-genetička dijagnostička metoda koja vam omogućava da identifikujete različite zarazne i nasljedne bolesti kod ljudi, kako u akutnoj tako i u kroničnoj fazi, i mnogo prije nego što se bolest može manifestirati.

PCR metoda je apsolutno specifična i, ako se pravilno izvede, ne može dati lažno pozitivan rezultat. Odnosno, ako nema infekcije, onda analiza nikada neće pokazati da ona postoji. Stoga, sada vrlo često, da bi potvrdili dijagnozu, dodatno rade PCR test kako bi se utvrdio patogen i njegova priroda.

Lančanu reakciju polimeraze (PCR) razvio je Kary Mullis (SAD) 1983. godine, za koju je 1993. godine dobio Nobelovu nagradu za hemiju.

Koja je prednost ove metode?

Dijagnostika ovom metodom omogućava vam da pronađete patogen direktno u genu koji je sadržan u materijalima koji se proučavaju. Ovo je najprecizniji test za spolno prenosive infekcije, skrivene infekcije i razne spolno prenosive bolesti.

Razlike između PCR dijagnostike i drugih laboratorijskih metoda istraživanja su kako slijedi:

• metoda je usmjerena na identifikaciju samog patogena;
• Dijagnostika pomoću PCR metode odlikuje se svojom svestranošću: za otkrivanje nekoliko patogena;
• bolesti dovoljan je samo jedan biološki uzorak pacijenta;
• metoda je vrlo osjetljiva i nije praćena drugim unakrsnim reakcijama.

Osim toga, prednost PCR dijagnostike je u tome što je za analizu pogodan bilo koji biološki materijal pacijenta: krv, genitalni sekret, urin, sperma.

Koje infekcije može otkriti PCR bris?

U tijelu može biti prisutan veliki broj infektivnih agenasa, uključujući i „skrivene“ koji se dugo vremena ne manifestiraju.

PCR analiza razmaza omogućava vam da otkrijete takve infekcije:

• ureplazmoza genitalnih organa;
• kandidijaza();
• herpes;
• prisustvo ćelija raka;
• procijeniti hormonski status;

Testni materijal za PCR je obično sputum, pljuvačka, urin i krv. Prije izvođenja analize, morate se pažljivo pripremiti za nju tako što ćete se prvo posavjetovati s liječnikom.

Krv za PCR obično se daruje na prazan želudac. Dobre rezultate pokazuje analiza kada se materijal za istraživanje uzima iz cervikalnog kanala ili uretre. U tom slučaju je najbolje provesti PCR dijagnostiku najkasnije jedan dan nakon spolnog odnosa.

Vrste PCR

PCR se koristi u mnogim područjima za testiranje i naučne eksperimente. Postoje različite metode analize:

1. PCR reverzne transkripcije(Reverzna transkripcija PCR, RT-PCR) - koristi se za amplifikaciju, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz RNK biblioteke.
2. Invertirani PCR(Inverzni PCR) - koristi se kada je poznat samo mali region unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada je u pitanju određivanje susjednih sekvenci nakon što je DNK umetnuta u genom.
3. Nested PCR se koristi za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Koriste se dva para prajmera i provode se dve uzastopne reakcije.
4. Asimetrični PCR(eng. Asymmetric PCR) - sprovodi se kada je potrebno amplifikovati pretežno jedan od lanaca originalne DNK. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije.
5. Kvantitativni PCR(Kvantitativni PCR, Q-PCR (engleski)) ili PCR u realnom vremenu - koristi se za direktno praćenje mjerenja količine određenog PCR proizvoda u svakom ciklusu reakcije.
6. Korak po korak PCR (Touchdown PCR) - korištenjem ovog pristupa smanjuje se utjecaj nespecifičnog vezivanja prajmera.
7. Grupno specifičan PCR(eng. group-specific PCR) - PCR za srodne sekvence unutar iste ili između različitih vrsta, koristeći konzervativne prajmere za ove sekvence.

Ako je nukleotidna sekvenca šablona djelimično poznata ili je uopće nepoznata, mogu se koristiti degenerirani prajmeri, čija sekvenca sadrži degenerirane pozicije u kojima se može nalaziti bilo koja baza. Na primjer, sekvenca prajmera može biti: ...ATH..., gdje je H A, T ili C.

Koji biološki materijali se proučavaju?

Različiti biološki mediji i ljudske tekućine mogu poslužiti kao materijal za PCR istraživanja, u kojima se može otkriti strana bakterijska DNK ili virusna DNK ili RNK:

1. Urin. Može se koristiti za infekcije genitourinarnog trakta kod muškaraca i mokraćnih organa kod žena (kod muškaraca upotreba urina kao materijala zamjenjuje struganje epitela).
2. Sputum. Koristi se za dijagnostiku tuberkuloze i, rjeđe, za dijagnosticiranje respiratornih oblika klamidije i mikoplazmoze. Sputum u količini od 15-20 ml sakuplja se u sterilnu (jednokratnu) bočicu.
3. Biološke tečnosti. Prema indikacijama se prikupljaju sok prostate, pleuralna, spinalna, amnionska tečnost, zglobna tečnost, bronhoalveolarno ispiranje, pljuvačka.
4. Epitelni strugoti sa sluzokože. Obično se koristi za dijagnosticiranje spolno prenosivih bolesti (STD), kao što su gonoreja, klamidija, mikoplazmoza, ureaplazmoza, trihomonijaza, gardnereloza, herpes i druge infekcije koje pogađaju sluznicu.
5. Biopsije. Najčešće se za otkrivanje infekcije Helicobacter pylori koriste biopsije želuca i duodenuma.
6. Krv, plazma, serum. Koristi se za PCR analizu hepatitisa B, C, D, G, herpesa, CMV, HIV virusa i istraživanja ljudskih gena.

Kako se pripremiti za test?

Pouzdanost PCR rezultata direktno zavisi od ispravnog predaja materijala na ispitivanje. Materijal ne smije biti kontaminiran, inače rezultat studije neće biti objektivan. Najvažnije preporuke prije polaganja PCR testa uključuju sljedeće zahtjeve:

1. Urin se sakuplja ujutro u sterilnu posudu.
2. Test krvi za infekcije se mora uzeti ujutru na prazan želudac.
3. Ne biste trebali biti seksualno aktivni dan prije testa.

Rezultat analize će biti gotov 1,5-2 dana nakon predmetne procedure. Postoje situacije kada se rezultat može pripremiti istog dana.

Dekodiranje OPC analize

Proces interpretacije prikazanog istraživanja odlikuje se jednostavnošću. Rezultati PCR analize mogu se dobiti 1,5-2 dana nakon predaje materijala. U nekim slučajevima, rezultat je spreman već prvog dana, a evo šta oni mogu značiti:

• Negativan rezultat pokazuje da dijagnostički materijal ne sadrži željeni infektivni agens.
• PCR pozitivan znači da je DNK ili RNK patogena prisutna u ljudskom tijelu.

U nekim slučajevima, mikroorganizmi se kvantificiraju. To se posebno odnosi na bolesti uzrokovane oportunističkim mikroorganizmima. Budući da ove bakterije ispoljavaju svoje negativno djelovanje samo u prevelikim količinama.

Takođe, kvantitativna PCR analiza je važna za odabir terapijskih taktika i u svrhu praćenja liječenja virusnih infekcija kao što su HIV i virusi hepatitisa.

Koliko je tačna PCR dijagnoza infekcija?

PCR metodu karakterizira visoka preciznost, specifičnost i osjetljivost. To znači da ova analiza može:

• precizno utvrditi prisutnost ili odsustvo infekcije;
• navesti o kojoj se vrsti infekcije tačno radi (specifičnost);
• otkriti infekciju čak i s vrlo niskim sadržajem mikrobne DNK u biološkom materijalu,
• koji je testiran (osetljivost).

PCR analiza: cijena i uvjeti

Cijena određenog testa ovisit će o tome na koju infekciju ćete se testirati. Okvirne cijene i termini:

1. STI: 300-500 rubalja, termini – 1 dan;
2. Epstein-Barr virus, humani papiloma virus, herpes, citomegalovirus: 300-500 rubalja, termini - 1 dan;
3. Hepatitis A, B, C, D, G: kvalitativna analiza 650 rubalja, kvantitativna analiza 2000 rubalja. Termini – do 5 dana;
4. Antitijela na virus hepatitisa C, ukupno (Anti-HCV) – 420 rubalja;
5. Antitijela na virus hepatitisa C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 rubalja;
6. Helicobacter pylori: 300-400 rubalja, termini – 1 dan;
7. HIV (antitela i antigeni) – 380 rubalja;
8. HIV RNK, visokog kvaliteta – 3.500 rubalja;
9. HIV RNK, kvantitativno – 11.000 rubalja.

Da biste uštedjeli novac, možete odabrati fiksni paket analize. Ovu uslugu pruža većina klinika u kojima se možete testirati PRC metodom (invitro, onclinic, itd.).

Provođenje PCR analize (PCR dijagnostike) počinje prikupljanjem materijala za pregled kod ginekologa, urologa ili dermatovenerologa. Kvalitetu i pouzdanost naknadno dobijenih rezultata osiguravaju najviša kvalifikacija i veliko iskustvo ljekara medicinskog centra Euromedprestige, koji poštuju sva potrebna pravila za provođenje PCR analize: potpuna sterilnost, korištenje samo jednokratnih materijala.

Sakupljeni materijal iz četke stavlja se u posudu sa slanom otopinom. Nakon prikupljanja, uzorke treba što prije dostaviti u PCR laboratoriju.

PCR analiza se izvodi u laboratoriji u tri faze:

1. Ekstrakcija DNK
2. Amplifikacija fragmenata DNK
3. Detekcija produkata amplifikacije DNK

Ekstrakcija DNK je početna faza PCR dijagnostike, čija je suština sljedeća: liječnik uzima materijal za istraživanje od pacijenta i podvrgava ga posebnoj obradi. Tokom obrade, dvostruka spirala DNK se dijeli na pojedinačne niti. Materijalu pacijenta dodaje se posebna tekućina koja otapa organske tvari koje ometaju "čistoću" reakcije. Ovo uklanja lipide, aminokiseline, peptide, ugljikohidrate, proteine ​​i polisaharide. Kao rezultat, formira se DNK ili RNK.

Princip PCR metode je “konstrukcija” novih DNK ili RNK infekcija. To se ne može učiniti bez uklanjanja ćelijskog materijala.

Količina vremena utrošenog na ekstrakciju DNK ovisi o uzročniku infekcije i o vrsti materijala koji se koristi za PCR istraživanje. Na primjer, potrebno je 1,5-2 sata da se krv pripremi za sljedeću fazu.

0Niz ( => Analize) Niz ( => 2) Niz ( =>.html) 2

DNK amplifikacija

Da bi izvršili sljedeću fazu DNK dijagnostike – amplifikaciju DNK – liječnici koriste takozvane DNK matrice – DNK molekule infekcija, na koje će naknadno doći do „kloniranja“ DNK. Već je spomenuto da prisustvo kompletne DNK infekcije nije potrebno da bi se izvela ova faza, dovoljan je mali komadić molekule DNK, koji je karakterističan samo za dati mikrob (infekciju).

Osnova amplifikacije DNK i, shodno tome, osnova cjelokupnog principa PCR reakcije je prirodni proces kompletiranja DNK za sva živa bića – replikacija DNK, koja se provodi udvostručavanjem jednog lanca DNK.

Počevši od jednog jedinog fragmenta DNK, laboratorijski doktor ga kopira i povećava broj kopija u režimu lančane reakcije: nakon prvog ciklusa već imate 2 fragmenta, nakon drugog ciklusa - 4, nakon trećeg - 8, nakon četvrti - 16, pa 32, 64, 128, 256... Sa svakim ciklusom se broj kopija udvostručuje, a nakon dvadeset ciklusa broj se već kreće u milione, a nakon trideset - u milijarde. Ciklus traje nekoliko minuta i svodi se na određenu promjenu temperature u vrlo malom hemijskom reaktoru. Ovdje, u otopini, sve potrebne komponente sinteze su prisutne u dovoljnim količinama, prije svega, nukleotidi A, G, T i C, a također se provode delikatne pripremne kemijske operacije tako da se odmah uzima tačna kopija iz svakog gotov segment DNK, zatim iz ove kopije - opet kopija, ovo je razgranata lančana reakcija.

Pričvršćivanjem prajmera na lanac DNK – umjetno sintetiziranih “komadića” DNK (parova nukleotida) sličnih DNK mikroba (infekcija) – formiraju se dvije kratke spirale koje se sastoje od dva lanca DNK sekcija, koje su neophodne za sintezu budućih DNK.

Sinteza novog lanca odvija se dovršavanjem svakog od dva lanca DNK. Proces amplifikacije odvija se uz pomoć specifične regije - DNK polimeraze, koja daje naziv laboratorijskoj metodi. Polimeraza djeluje kao katalizator reakcije i prati sekvencijalno vezivanje nukleotidnih baza na rastući novi lanac DNK.

Dakle, amplifikacija DNK je višestruko povećanje broja kopija DNK koje su specifične, odnosno svojstvene samo određenom organizmu. Nema potrebe da se kompletira ceo lanac DNK da bi se video infektivni agens. Potrebno je samo područje koje je karakteristično za datu bakteriju kao individuu.

5360 rub. Cijena sveobuhvatnog programa sa gastroenterologom

POPUST 25% NA KARDIOLOGU

- 25%primarni
Poseta lekaru
terapeut vikendom

5.160 RUB umjesto 5.420 rub. Skrining muškaraca na urološke infekcije

ALLERGOLOGY 5.120 RUB umjesto 5.590 rub.

Svi koraci pojačanja koji se vrlo ponavljaju javljaju se na različitim temperaturama. Za obavljanje PCR analize koristi se posebno programabilna oprema - PCR - termostat ili pojačalo, koji automatski mijenja temperature. Amplifikacija se provodi prema datom programu koji odgovara vrsti infekcije koja se otkriva. U zavisnosti od programa i vrste infekcije koja se otkriva, automatizovani PCR proces traje od 2 do 3 sata.

Kvalifikacije laboratorijskog doktora koji obavlja analizu igra važnu ulogu u PCR dijagnostici. Pravilna podešavanja PCR opreme i interpretacija rezultata zavise od njega. Lekari Medicinskog centra Euromedprestige imaju veliko iskustvo u sprovođenju DNK dijagnostike, što obezbeđuje pouzdanost rezultata istraživanja i garantuje pozitivan uspeh u lečenju zaraznih bolesti. Da uradite PCR testove i izvršite kompletnu dijagnostiku i lečenje zaraznih bolesti u našem medicinskom centru Euromedprestige.

Tokom detekcije produkata amplifikacije, dobijena mješavina produkata amplifikacije se odvaja. Smjesi se dodaju specijalne otopine, koje fragmentima DNK daju sposobnost fluorescencije – reflektiraju se u narandžasto-crvenim svjetlećim prugama. Rezultirajući sjaj ukazuje na prisutnost DNK virusa, mikroba ili bakterija u materijalu uzetom od pacijenta za PCR analizu.

Stranica pruža referentne informacije samo u informativne svrhe. Dijagnoza i liječenje bolesti moraju se provoditi pod nadzorom specijaliste. Svi lijekovi imaju kontraindikacije. Konsultacija sa specijalistom je obavezna!

Metoda lančana reakcija polimeraze otkrio je prije skoro trideset godina američki naučnik po imenu Carrie Mullis. Tehnika se široko koristi u medicini kao dijagnostički alat, a njena suština je kopiranje dijela DNK pomoću posebnog enzima ( polimeraze) vještački in vitro.

U kojim oblastima medicine se koristi ova metoda?

Zašto se vrši kopiranje DNK i kako može poslužiti medicini?
Ova tehnika omogućava:

• Izolujte i klonirajte gene.
• Dijagnostikovanje genetskih i zaraznih bolesti.
• Utvrditi očinstvo. Dijete nasljeđuje neke od svojih genetskih karakteristika od svojih bioloških roditelja, ali ima svoj jedinstveni genetski identitet. Prisustvo nekih gena koji su identični genima roditelja omogućava nam da govorimo o uspostavljanju veze.

Lančana reakcija polimerazom se također koristi u forenzičkoj praksi.

Na mjestima zločina forenzičari prikupljaju uzorke genetskog materijala. To uključuje: kosu, pljuvačku, krv. Nakon toga, zahvaljujući tehnici reakcije polimeraze, DNK se može pojačati, a identitet uzetog uzorka može se uporediti sa genetskim materijalom osumnjičene osobe.

Lančana reakcija polimeraze se efikasno koristi u medicini:

• U pulmološkoj praksi - za razlikovanje bakterijskih i virusnih vrsta pneumonije, tuberkuloze.
• U ginekološkoj i urološkoj praksi - za određivanje ureaplazmoze, klamidije, mikoplazma infekcije, gardnereloze, herpesa, gonoreje.
• U gastroenterološkoj praksi.
• U hematologiji - za određivanje onkovirusa i citomegalovirusne infekcije.
• U brzoj dijagnostici zaraznih bolesti kao što su virusni hepatitis, difterija, salmoneloza.

Trenutno je ova metoda najčešća u dijagnostici zaraznih bolesti ( hepatitis virusne etiologije, HIV, polno prenosive bolesti, tuberkuloza, krpeljni encefalitis).

Šta se dešava tokom reakcije?

Sama reakcija je hemijski jednostavna. Izvor DNK za reakciju može biti kap krvi, kosa, komad kože itd. U teoriji, reakcija zahtijeva potrebne reagense, epruvetu, biološki uzorak i izvor topline.

Reakcija polimeraze omogućava otkrivanje infekcije, čak i ako uzorak koji sadrži biološki materijal sadrži samo jedan ili više molekula DNK patogena.

Tokom reakcije, zahvaljujući enzimu DNK polimerazi, dolazi do udvostručavanja ( replikacija) dio DNK. Sama deoksiribonukleinska kiselina ( skraćeno kao DNK) je važno za nas jer osigurava pohranjivanje i prijenos genetskih informacija do ćelija kćeri. DNK ima oblik heliksa, koji se sastoji od blokova koji se ponavljaju. Ovi blokovi čine nukleotide, koji su najmanja jedinica DNK. Nukleotidi se formiraju od aminokiselina.

Proces replikacije DNK sekcija odvija se tokom ponovljenih ciklusa. U svakom takvom ciklusu ne kopira se i udvostručuje se ne samo originalni fragment DNK, već i oni fragmenti koji su već udvostručeni u prethodnom ciklusu amplifikacije. Sve ovo liči na proces geometrijske progresije.

Postoji:

• Prirodno pojačanje ( odnosno proces kopiranja i umnožavanja DNK), koji se javlja u našem tijelu i deterministički je, unaprijed određen proces.
• Umjetna amplifikacija, koja nastaje zbog lančane reakcije polimeraze. U ovom slučaju, proces kopiranja je kontroliran i omogućava umnožavanje čak i kratkih dijelova nukleinske kiseline.

Nakon što je svaki ciklus kopiranja završen, broj fragmenata nukleinske kiseline raste eksponencijalno. Zato se sam proces naziva "lančana reakcija".

Nakon trideset do četrdeset ciklusa, broj fragmenata dostiže nekoliko milijardi.

Za pojačanje in vitro (in vitro) potrebno je da određeni strani fragment DNK ( to jest, DNK nije od pacijenta, već od patogena). Ako stvorena otopina ne sadrži određeni fragment, neće doći do lančane reakcije pod djelovanjem polimeraze. Ovo objašnjava činjenicu visoke specifičnosti PCR-a.

Faze PCR dijagnostike

1. DNK je izolirana iz materijala koji se proučava.
2. DNK se dodaje u poseban rastvor nukleotida.
3. Rastvor se zagreva na temperaturu od 90 - 95 stepeni Celzijusa tako da se DNK protein koagulira.
4. Smanjite temperaturu na 60 stepeni.
5. Kako se ciklusi povećanja i smanjenja temperature ponavljaju, broj mjesta nukleinske kiseline se povećava.

6. Izvođenjem elektroforeze rezultati se sumiraju i izračunavaju se rezultati udvostručenja.

Koje su prednosti ove dijagnoze?

• Svestranost: Bilo koji uzorak nukleinske kiseline je pogodan za ovu metodu.
• Visoka specifičnost: patogen ima jedinstvene sekvence DNK lanaca koji su specifični za njega. Stoga će rezultati PCR-a biti pouzdani, nemoguće je pomiješati gen jednog patogena s genom drugog patogena.
• Osetljivost na prisustvo čak i jednog molekula patogena.

• Mala količina materijala potrebna za istraživanje. Čak i kap krvi može. Mogućnost dobijanja rezultata korišćenjem minimalne zapremine uzorka veoma je važna za pedijatrijske, neonatološke, neurološke studije, kao i u praksi sudske medicine.
• Sposobnost utvrđivanja indolentne, kronične infekcije, a ne samo akutne.
• Mnoge patogene kulture je vrlo teško uzgajati in vitro drugim metodama, ali reakcija polimeraze omogućava razmnožavanje kulture u potrebnoj količini.

Koje nedostatke ima ova dijagnoza?

• Ako materijal namijenjen za PCR sadrži DNK ne samo živog patogena, već i mrtvog, doći će do amplifikacije oba DNK. Shodno tome, liječenje propisano nakon dijagnoze možda neće biti potpuno ispravno. Nakon nekog vremena, bolje je pratiti efikasnost liječenja.
• Povećana osjetljivost na prisustvo mikroorganizama također se može smatrati, na neki način, nedostatkom. Uostalom, ljudsko tijelo inače sadrži oportunističku mikrofloru, odnosno to su mikroorganizmi koji žive u crijevima, želucu i drugim unutrašnjim organima. Ovi mikroorganizmi mogu nanijeti štetu čovjeku samo pod određenim nepovoljnim uvjetima – nepoštovanje higijenskih zahtjeva, kontaminirana voda za piće itd. PCR tehnika umnožava DNK čak i ovih mikroorganizama, iako ne dovode do patologije.
• PCR različitih test sistema može pokazati rezultate koji će se međusobno razlikovati. Postoje mnoge modifikacije ove tehnike: “ ugniježđen», « asimetrično», « obrnuto», « kvantitativno» PCR i drugi.

Sadržaj

Oni koji su zainteresovani za nove dijagnostičke metode treba da saznaju šta je to PCR metoda. Savremene tehničke mogućnosti u oblasti laboratorijskih istraživanja pružaju mogućnost otkrivanja mnogih bolesti u početnim fazama. Lančana reakcija polimerazom (PCR) trenutno se smatra najpreciznijom i novom metodom.

PCR analiza

PCR analiza - šta je to? Ova metoda koristi principe molekularne biologije. Za proučavanje materijala koriste se posebni enzimi koji više puta i brzo kopiraju fragmente DNK i RNK patogena. Postoje različite vrste PCR analize u zavisnosti od materijala koji se testira (krv, urin, izmet, itd.). Nakon obrade, laboratorijsko osoblje upoređuje dobiveni rezultat sa bazom podataka, identifikuje koncentraciju i vrstu patogena.

PCR analiza se stavlja u poseban ciklus (uređaj), koji zagrijava i hladi epruvete sa biomaterijalom. Promjene temperature su neophodne za replikaciju fragmenta. Točnost rezultata ovisit će o tačnosti temperaturnog režima. Metoda lančane reakcije polimerazom pomaže u identifikaciji:

• Infektivna mononukleoza;
• infekcija citomegalovirusom;
• virusni hepatitis G, C, B, A;
• spolno prenosive infekcije/bolesti (SPI/SPB): gardnereloza, trihomonijaza, ureaplazmoza;
• herpes infekcija;
• onkogeni virusi;
• listerioza;
• infekcija Helicobacter pylori;
• krpeljni encefalitis, borelioza;
• tuberkuloza;
• kandidijaza.

Krv

U ovom trenutku, zbog novosti tehnologije, PCR testiranje krvi i dalje ima visoku cijenu. Za pripremu biomaterijala ne morate ispunjavati određene zahtjeve. Čak i promjene u sastavu uzrokovane fizičkom aktivnošću, stresom ili promjenama u ishrani ne utječu na rezultate studije. PCR test krvi može se pokvariti samo uzimanjem antibakterijskih sredstava, tako da prije uzimanja testa morate napraviti pauzu između tretmana i testa.

PCR testiranje krvi je najčešća opcija za dijagnosticiranje kroničnih, akutnih infektivnih patologija s virusnim ili atipičnim manifestacijama. Serološke metode istraživanja imaju određene poteškoće u njihovoj primjeni - prisutnost patogena određuje se prisustvom antitijela u ljudskom tijelu. Rezultat bi mogao biti lažno negativan ako stanje pacijenta nije omogućilo vrijeme za njihov razvoj.

razmazati

U oblasti ginekologije, PCR analiza razmaza se koristi za proučavanje prisustva infektivnih mikroorganizama. Rad s materijalom provodi se po istom principu kao i s krvlju: višestruko povećanje fragmenata DNK patogena kako bi se lako identificirao. Ovo također pomaže u otkrivanju skrivenih infekcija kod žena. Za analizu se mogu uzeti različite biološke tekućine: pljuvačka, sputum, urin, krv. U ginekologiji se za precizno određivanje često koristi bris vaginalne sluznice iz cervikalnog kanala.

Postoje određene indikacije za izvođenje PCR-a. Često je to potrebno učiniti kako bi se identificirao patogen otporan na antibiotike. Kod žena, glavne indikacije za dijagnozu ovom metodom su:

• trudnoća koja je teška;
• akutna faza SPI;
• ako postoji sumnja da je SPI prešla u hroničnu fazu;
• traženje uzroka neplodnosti.

Kala

Za otkrivanje infekcije, liječnik može propisati PCR test stolice. Da biste dobili najpouzdanije rezultate nakon testa, morate se pridržavati sljedećih pravila prije prikupljanja biomaterijala:

• prestati uzimati laksative nekoliko dana prije: ulja, supozitorije;
• isključite lijekove koji daju određenu boju stolici, na primjer, koji sadrže željezo.

Urin

Ako je potrebno, Vaš ljekar može uzeti urin za testiranje. Visoka preciznost otvara mogućnost rada sa bilo kojom biološkom tekućinom iz koje se može izdvojiti virusna DNK. Da biste napravili PCR test urina, morate se pridržavati sljedećih ograničenja prije prikupljanja materijala:

• prekinuti seksualni odnos najmanje 1 dan prije zahvata;
• 3 sedmice prije testa potrebno je završiti bilo kakav antibakterijski tretman, jer će lijekovi zamagliti sliku;
• Test morate uraditi na prazan želudac (tečnosti su takođe zabranjene);
• Morate uzeti prvu jutarnju porciju materijala.

Rezultati PCR testa

Iz navedenog je jasno šta je PCR analiza i vidljive su jasne prednosti ove metode istraživanja. Još jedna prednost ove dijagnostičke procedure je lakoća dešifriranja rezultata. S obzirom na to koliko dugo traje PCR analiza (sam proces traje oko 5 sati, ali laboratorija proizvodi podatke za 1-2 dana), ova dijagnostička metoda postaje najbolja opcija za identifikaciju mnogih infekcija. Na osnovu rezultata, Vaš lekar Vam može reći da test:

1. Negativno – testni materijal nije sadržavao željeni patogen.
2. Pozitivno - pronađeni su RNK i DNK patogena.

Ponekad se provodi kvantitativno određivanje mikroorganizama. Ovo je neophodno za bolesti koje su uzrokovane oportunističkim patogenima. Posebnost ovih virusa je u tome što se pojavljuju samo u prevelikim količinama i izuzetno je problematično pronaći ih konvencionalnim istraživanjima. Ovaj faktor je važan za odabir terapijskih taktika za efikasno liječenje virusnih infekcija, na primjer, hepatitisa, HIV-a.

Za 12 infekcija

Da biste u potpunosti razumjeli šta je PCR dijagnostika infekcija i koliko je efikasna, morate znati da može izolirati do 12 patogena. Tekst se izvodi samo u laboratorijskim uslovima. Za istraživanje se koriste posebni enzimi koji višestruko povećavaju količinu RNA i DNK fragmenata virusa. PCR analiza za 12 infekcija može otkriti:

• Mycobacterium tuberculosis;
• citomegalovirus;
• hepatitis C, G, B, A;
• herpes 1, 2 vrste;
• Epstein-Barr virus (infektivna mononukleoza);
• infekcije koje se prenose spolnim putem, na primjer, klamidija;
• listerioza;
• infekcija kandidom;
• Helicobacter pylori;
• borelioza, krpeljni encefalitis.

Za hepatitis C

Ova dijagnostička metoda pomaže u određivanju prisutnosti virusa u krvi. To daje liječnicima priliku da govore o njegovom prisustvu ili odsustvu. Postoje dvije vrste PCR analize za hepatitis C: kvalitativna i kvantitativna. Prva opcija označava samo njegovo prisustvo i može imati formulaciju „otkriveno”/„nije otkriveno”. Ova vrsta testa ima osjetljivost od 10-500 IU/ml. To sugerira da ako je sadržaj patogena u tijelu nizak, analiza neće biti "otkrivena".

Kvantitativna analiza je preciznija i pokazaće koncentraciju infekcije u krvi. Ovaj indikator se naziva "virusno opterećenje" i mjeri se u količini virusne RNK po specifičnom volumenu krvi. Dekodiranje u različitim laboratorijama može se razlikovati. Pored mjerenja IU/ml, koriste se jedinice za “kopiranje”. Možete računati kopije po IU koristeći formulu: 1 IU = 4 kopije. Ako vrijednost dekodiranja za prisustvo virusa prelazi 800.000 IU/ml (ili 800*103), to ukazuje na visok sadržaj patogena.

Za tuberkulozu

Test treba uraditi ujutru. Ovo je važno kako bi se spriječilo da cjelokupna masa sputuma koja se stvorila preko noći ne napusti želudac. PCR analiza za tuberkulozu je jednako važna kao ELISA, Mantoux i tomografija. Test pomaže da se utvrdi prisustvo mikobakterija, stanje mokraće, ukupnog imunoglobulina, ESR i utvrdi trenutno stanje pluća. Da bi se osigurali tačni rezultati prilikom analize PCR-a, ona se mora provesti u skladu sa sljedećim pravilima:

1. Setva se vrši 3 puta, ali potpunu aspiraciju želudačnog sadržaja treba izvršiti samo u bolničkim uslovima.
2. Mikobakterije se otkrivaju kulturom postojećih masa u želucu u manje od 50% dijagnoza. Čak i kada se postignu optimalni uslovi, preporučuje se ultrazvuk.
3. Čak i ako je rezultat negativan, ne može se potpuno isključiti mogućnost razvoja tuberkuloze s promjenama ESR, imunoglobulina ili drugih pokazatelja.
4. Kultura materijala tokom PCR-a manje je podložna patološkim stanjima ako se dobije u sklopu bronhoskopskog pregleda, čime se isključuje sumnja na tuberkulozu kod djeteta.

Za HIV

Za mnoge ljude ova dijagnoza se smatra smrtnom kaznom. Iz tog razloga, nakon čestih spolnih odnosa, osoba postaje pažljivija na signale koje tijelo daje (a ponekad ih i izmišlja). Najpouzdanija opcija za dobijanje potvrde ili opovrgavanja ove bolesti je PCR test na HIV. Test se može koristiti za utvrđivanje sljedećih mogućih zdravstvenih problema:

1. Pobijanje/potvrda prisustva HIV-a tokom seronegativnog perioda.
2. Određivanje genotipa HIV-1, HIV-2.
3. Pojašnjenje opisa patološkog procesa u slučaju upitnih rezultata imunoblota.
4. Infekcija nakon transfuzije krvi.
5. Određivanje HIV statusa kod djece rođene od majki koje su nosioci bolesti.
6. Pomaže u uspostavljanju praćenja virusnog opterećenja organizma.

Za HPV

Papiloma virus se može otkriti kod bilo koje osobe; Razvoj je izazvan oslabljenim imunitetom, stresom ili emocionalnim izljevima. PCR test za HPV pomaže u određivanju koncentracije virusa u krvi. Iz tog razloga, preporučuje se da se određivanja vrše kvantitativno, a ne kvalitativno. Ovi podaci će pomoći da se predvidi vjerovatnoća maligne infekcije.

Metoda za dijagnosticiranje prisustva HPV-a zasniva se na glavnom svojstvu PCR-a da izoluje virusnu DNK iz materijala. Zbog visoke osjetljivosti testa, čak i male količine bakterija će se otkriti. Kvantitativno istraživanje pruža ljekarima mogućnost da utvrde stepen opasnosti od bolesti i daju prognozu za budućnost. Ova dijagnoza je obavezna za sve muškarce i žene kod kojih su otkriveni kondilomi. Kvantitativna PCR analiza pomoći će da se utvrdi što je uzrokovalo razvoj HPV-a: privremeno smanjenje imuniteta ili kronična bolest.

Za herpes

Ova vrsta mikrobiološke dijagnostike pomaže u izvođenju PCR analize na herpes sa visokom preciznošću. Kopiranje fragmenata virusne DNK će se dogoditi samo ako je željeni gen prisutan u materijalu. U ovom slučaju, rezultati testa mogu ukazivati ​​na prisustvo ili odsustvo patogena. Može se otkriti čak i pri niskim koncentracijama u krvi.

Još jedna prednost PCR testa je što može otkriti herpes virusnu infekciju odmah nakon infekcije, prije pojave kliničkih simptoma. Možete odrediti vrstu herpesa (1 ili 2 nije potrebna posebna priprema za uzimanje testa, ali liječnici preporučuju da prije uzimanja krvi odbijete:);

• pržena;
• akutna;
• alkohol;
• debeo.

Tokom trudnoće

Prilikom nošenja djeteta veoma je važno provesti ovo istraživanje kako bi se registrovalo stanje žene. PCR analiza tokom trudnoće uvrštena je u listu najefikasnijih metoda za utvrđivanje prisutnosti različitih bolesti. Test je neophodan ne samo za identifikaciju patologija, već i za određivanje vjerojatnosti infekcije djeteta u maternici. Samo zahvaljujući PCR dijagnostici postalo je moguće identificirati stupanj progresije, razvoj mnogih infekcija unutar maternice.

Uzimanje PCR testova

Ako se pitate kako se uzima PCR analiza, onda treba razmotriti svaki pojedinačni slučaj, uzimajući u obzir vrstu biomaterijala. Struganje, bris ili vađenje krvi imaju svoje karakteristike, na primjer:

• plazma se donira ujutro;
• urin se uzima samo prvo ujutro, u laboratorijskim uslovima u sterilnoj posudi;
• bris ili struganje će biti indikativni samo nakon suzdržavanja od seksualnog odnosa najmanje 3 dana;
• Ne možete uzeti bris tokom menstruacije i 2 dana nakon nje.

Gdje se testirati za PCR

Ova vrsta istraživanja odnosi se na moderne i visokotehnološke dijagnostičke metode. Testove primjenom PCR metode treba obaviti u laboratorijama koje imaju svu potrebnu opremu za dobivanje potpunih rezultata. Kvalificirano i obučeno osoblje igra jednako važnu ulogu. Dajte prednost velikim, ozbiljnim, poznatim laboratorijama. Ovo ne samo da će vam pomoći da brzo dobijete rezultate, već će i osigurati njihovu pouzdanost.

Cijena

Još jedno pitanje koje često zanima pacijente: koliko košta PCR test? Zbog novine metode i potrebe za nabavkom skupe opreme, cijena testa je relativno visoka. Cijena PCR-a ovisi o vrsti infekcije na koju će osoba biti testirana. Okvirna cijena i vrijeme testiranja su kako slijedi:

1. SPI će se provjeriti za 1 dan, cijena je 400-500 rubalja.
2. Herpes, HPV, Epstein-Barr virus, citomeglovirus se otkrivaju u roku od 24 sata, cijena - 300-500 rubalja.
3. Analiza hepatitisa se provodi u roku od 5 dana, cijena za kvalitativnu opciju je 500 rubalja, kvantitativna opcija je 2000 rubalja.
4. Helicobacter pylori se otkriva u roku od 24 sata, cijena je 400 rubalja.
5. Antigeni, antitijela na HIV, cijena - od 380 rubalja.
6. Kvalitativna analiza HIV RNK, cijena - od 3.500 rubalja.
7. Kvantitativna analiza HIV RNK, cijena - od 11.000 rub.

Video

Pažnja! Informacije predstavljene u članku su samo u informativne svrhe. Materijali u članku ne potiču na samoliječenje. Samo kvalificirani liječnik može postaviti dijagnozu i dati preporuke za liječenje na osnovu individualnih karakteristika određenog pacijenta.

Pronašli ste grešku u tekstu? Odaberite ga, pritisnite Ctrl + Enter i sve ćemo popraviti!

Povratak